一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型制造技术

本发明专利技术属于医药配制品技术领域，公开了一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型，药物为吲哚‑3‑甲醇，对HaCaT细胞最大无作用剂量为10μmol/L。取处于对数生长期的HaCaT细胞，按2×10

【技术实现步骤摘要】
一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型
本专利技术属于医药配制品
，尤其涉及一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型。
技术介绍
人的皮肤老化是一个非常复杂的过程，遗传因素及环境因素同时对其产生影响。目前发现环境因素中的紫外线是引起皮肤老化一个重要诱因，人体的皮肤每天都接受着来自太阳光中紫外线的辐射，研究表明长期的紫外线辐射将导致皮肤光老化，甚至导致皮肤癌的发生。随着人类生活水平的提高以及老龄人口的增长，皮肤老化问题已日益引起人们的重视。由于大气臭氧层的破坏不断加剧以及生活习惯等方面的原因，皮肤光老化也已成为威胁现代人类的重要健康问题之一。皮肤光老化的临床表现主要为：皮肤松弛、结节、皮革样外观、明显干燥和脱屑，光老化部位皮肤呈黄色或灰黄色、较粗糙，久之出现色素斑点或类似老年斑等色素沉着异常。长期日光照射还可诱发一系列增生性病变，如脂溢性角化病、胶样粟丘疹、光线性肉芽肿、日光性角化病等，严重者可能发生皮肤癌等恶性肿瘤。皮肤光老化的组织学表现主要见于表皮和真皮。表皮光老化轻微损伤表现为表皮层轻度修复性增厚，严重损伤时表皮萎缩、基底层细胞发生异质性改变，使皮肤革化、变脆、变硬，甚至出现水泡。光老化可致色素过度沉着，表现为肤色不均、出现雀斑、黑色素过少症等。光老化发生时真皮层明显增厚，形成大量无功能、退化的或功能紊乱、易被降解的弹性纤维，从而使皮肤出现松弛、变皱的表现，过度伸展后可出现皮肤裂纹。紫外线可通过诱导蛋白激酶信号通路活化、诱导活性氧生成、激活表皮细胞生长因子及诱导金属蛋白酶类表达等途径诱发皮肤光老化。大量实验证据表明，皮肤光老化的发生机理主要包括：(1)氧化应激损伤。皮肤组织在UV辐射作用下发生光化学反应产生大量活性氧自由基(ReactiveOxygenSpecies，ROS)，其主要机理是细胞表面受体被紫外线激活后与相应配体结合并激发下游信号分子，且激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，从而产生大量过氧化氢及超氧阴离子。ROS对DNA、蛋白质和脂类等细胞大分子物质进行攻击，造成皮肤组织细胞发生氧化应激损伤。(2)紫外线辐射诱导皮肤角质细胞(keratinocyte，KC)和成纤维细胞(fibroblast，FB)的转录因子AP-1异常活化。紫外线辐射引起KC和FB细胞上的生长因子及细胞因子受体如表皮生长因子受体(EGFR)、白介素1受体(IL-1R)等激活，EGFR和IL-1R介导的信号转导通路激活ERK和JNK等蛋白激酶，继而活化AP-1。AP-1一方面增加基质金属蛋白酶(MMPs)的高表达，降解真皮胶原，另一方面下调Ⅰ型和Ⅲ型前胶原(procollagen)mRNA合成，进而导致真皮胶原成分不断减少。此外，紫外线还可改变核因子κB(NuclearFactorκB，NF-κB)和转化生长因子β(transforminggrowthfactor，TGF-β)表达。而这些分子的表达与胶原合成、降解及炎性细胞因子产生有关且最终可引发皮肤光老化。具体通路可见下图。皮肤长期暴露于紫外线(ultravioletradiation，UVR)可出现多种不良反应包括形态学损害称为光老化(photoaging)。光老化，也称为皮肤过早衰老，临床上常见表现为皮肤粗糙，出现皱纹，皮肤毛细管扩张以及色素异常沉淀等。日常皮肤暴露的地方如面部、颈部、背部和前臂比较容易发生光老化。紫外线是波长为200～400nm的电磁波，其中波长为320～400nm的紫外线称为长波紫外线(UVA)，占有效紫外线辐射的95％左右。其穿透力强，目前已证实UVA照射皮肤可产生多种与皮肤光老化密切相关的生物效应：如产生ROS，引起脂质过氧化，红斑和毛细血管损伤，这在皮肤光老化发生中起到关键性的作用。紫外线是波长为200～400nm的电磁波，其中波长为200～290nm的紫外线称为短波紫外线(UVC)，波长为290～320nm的紫外线称为中波紫外线(UVB)，波长为320～400nm的紫外线称为长波紫外线(UVA)。对于地球上的生物来说，主要起作用的是UVA和少量UVB，紫外线中UVA、UVB分别占95％、5％左右，UVB主要作用于皮肤的表皮和真皮浅层，过量则主要造成光毒性和光损伤，长期以来，由于UVB生物效应较强而受到广泛研究，目前已发展出多种成熟有效的UVB遮光剂，它们能有效减少UVB对皮肤造成的损伤。然而，目前对UVA所致皮肤光老化的预防仍缺少有效措施。UVA能够渗透到皮肤乳头层和网状层真皮，可作用于表皮和真皮全层。UVA的生物学活性虽然不如UVB，但其穿透力强，能在真皮成纤维细胞脂质过氧化，使成胶原纤维受到影响而变形、断裂。其一次照射剂量要比UVB大1000倍以上。近年来研究表明UVA照射皮肤可产生多种与皮肤光老化密切相关的生物效应：如UVA辐射可通过内源性或外源性的化学基团产生氧自由基(ROS)，这些ROS会对细胞、组织造成损伤，进而导致氧化应激的发生，最终诱导多种重要的基质金属蛋白酶异常表达；另有研究表明，UVA可引起红斑和毛细血管损伤，这些都为光老化的发生提供了前提条件。ErikoShimada、KeiichiHiramoto等人已经成功地利用无毛小鼠动物模型，证实了UVA在皮肤光老化发生中起到关键性的作用，并提出了相应预防或缓解措施。因此，UVA在皮肤光老化性损伤中的作用是不能低估的，探索更多的预防缓解手段变得十分必要。流行病学和实验室数据提示十字花科蔬菜如花茎甘蓝、大白菜、萝卜、辣根、水田芥菜、花椰菜、西兰花等含有的生物活性植物化学物吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol，I3C)是一种活性较强的肿瘤化学预防物质，在消化道的酸性环境中，I3C转化成包括吲哚-3-甲醇(3，3'-Diindolylmethane，I3C)在内的一系列寡聚物从而在体内发挥生物学作用。I3C是I3C的二聚体，较I3C而言更具有稳定性。体内和体外实验均证明I3C可抑制多种肿瘤的发生和发展且无毒副作用：其表现出抗激素样活性，能够抑制某些激素依赖性的肿瘤；还可通过调节细胞周期、调节某些酶的活性，保护机体免受损伤，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。因此，I3C被认为是一种安全有效的预防和抗肿瘤的天然植物化学物。十字花科蔬菜如西兰花、萝卜、花椰菜等含有的生物活性植物化学物吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol，I3C)是一种活性较强的肿瘤化学预防物质。体内和体外实验均证明I3C可抑制多种肿瘤的发生和发展，是一种安全有效的预防和抗肿瘤的天然植物化学物。最近已经有研究显示I3C可通过抗氧化应激以及抗炎性反应来保护细胞、减少损伤。然而，I3C是否能通过此途径来预防或者延缓光老化目前还不明确。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术主要用来解决各种肿瘤的化学预防效应，尚未意识到其在预防延缓和减弱紫外线导致光老化效应方面的作用；I3C是否能通过抗氧化应激以及抗炎性反应来保护细胞、减少损预防或者延缓光老化目前还不明确。解决以上问题及缺陷的难度为：构建合适的细胞模型、探索有效的剂量范围，构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物，其特征在于，所述对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物为吲哚-3-甲醇，对HaCaT细胞最大无作用剂量为10μmol/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物，其特征在于，所述对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物为吲哚-3-甲醇，对HaCaT细胞最大无作用剂量为10μmol/L。


2.一种验证权利要求1所述对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物的动物模型构建方法，其特征在于，所述对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物的模型构建方法包括：
第一步，取处于对数生长期的HaCaT细胞，按2×105个/孔接种于6孔培养板中，在细胞培养箱中培养至70～80％的细胞融合度；
第二步，按如下分组处理：空白对照组用不透光的黑纸片遮住，UVA模型组的照射剂量为1J/cm2，I3C处理组在照射UVA的同时还用10μmol/L的I3C进行处理，每个剂量设2个平行样；照射完后观察细胞在数量和形态上的改变。


3.如权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于，所述模型构建方法细胞的培养和传代，HaCaT细胞用含10％v/vFBS、1％青霉素100U/ml，链霉素100mg/l的DMEM完全培养基，于37℃、5％CO2及饱和湿度的CO2培养箱内培养；培养至细胞融合度达到80～90％，在培养箱中用0.05％胰蛋白酶消化细胞；消化时间为2min，倒置显微镜下观察细胞开始收缩变圆，脱离皿/瓶底后，加入5ml完全培养基终止消化；用吸管充分吹散并丢弃多余细胞，加入7ml完全培养基传代，传代培养至第10～40代；
待生长状态良好的HaCaT细胞融合度达到80～90％融合度时，消化并转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，用无血清的培养基洗涤一次，再以900μlFBS及100μlDMSO重悬细胞后离心沉淀，将其移至冻存管内细胞的冻存密度为10×106个/ml，每个冻存管存1.5ml，并转入专用冻存盒，-80℃冰箱过夜，最后移入液氮罐内保存；
复苏细胞时，取出冻存管将其立即放入37℃水浴中，振摇至完全融化，转移至15ml离心管中，加入8.5ml完全培养基后1000rpm离心5min，弃去上清液，再加入完全培养基吹打成细胞悬液，将细胞悬液转移入培养瓶，置37℃、5％CO2培养箱培养，贴壁过夜后更换新的培养基。


4.如权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于，所述模型构建方法的I3C对HaCaT细胞增殖抑制，取处于对数生长期的HaCaT细胞，按0.5×104个/孔接种于96孔培养板中，在含有10％FBS、1％P&S的DMEM完全培养基中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜至40～50％细胞融合度；按如下分组给予受试物处理：对照组用等量的DMSO处理，I3C处理组用不同浓度1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L、15μmol/L、17.5μmol/L、20μmol/L的I3C进行处理，处理时间分别为24h、48h、72h，每个剂量设6个平行组；处理完毕后先观察细胞的形态和数量上的变化，之后每孔加入100L无血清的DMEM完全培养基，再加入10LCCK-8试剂，37℃孵育1～2h后，用全自动酶标仪测定各孔的吸光度OD值；以对照孔吸光度值AC为参照，根据各处理组样本孔的吸光度值AT，计算细胞活力抑制率：
(％)以评价细胞毒性：细胞活力抑制率(％)＝(1-AT/AC)×100％。


5.如权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于，所述模型构建方法的I3C对UVA照射HaCaT细胞增殖抑制影响，取处于对数生长期的HaCaT细胞，按0.5×104个/孔接种于96孔培养板中，在含有10％FBS、1％P&S的DMEM完全培养基中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜至40～50％细胞融合度；按如下分组给予受试物处理：空白对照组用不透光的黑纸片遮住，UVA模型组中UVA照射剂量分别为0.25J/cm2、0.5J/cm2、0.75J/cm2、1J/cm2、1.25J/cm2、1.5J/cm2，计算紫外线的照射剂量：照射剂量J/cm2＝照射强度W/cm2×照射时间s，照射强度通过紫外线辐照计测量测定；I3C处理组每孔在照射前24h加入10mg/gI3C，照射剂量和对照组一样，每个剂量设3个平行样；照射后换上培养基，放入培养箱中培养24h后观察细胞数量和形态上的改变，之后将每孔加入100L无血清的DMEM完全培养基，再加入10LCCK-8试剂，孵育1～2h后，用全自动酶标仪测定各孔的吸光度OD值；以对照孔吸光度值AC为参照，根据各处理组样本孔的吸光度值AT，计算细胞活力抑制率(％)以评价细胞毒性：细胞活力抑制率(％)＝(1-AT/AC)×100％，根据UVA对HaCaT细胞增殖的抑制率以及I3C的保护作用，确定UVA在后续实验中的照射剂量。


6.如权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于，所述模型构建方法的克隆形成实验，低密度接种50个细胞/皿于10cm皿中，接种24h后，分为对照组和实验组：对照组不做任何处理，实验组分别用5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L的I3C处理，每个剂量设3个平行组，连续培养3周，期间隔1天换一次培养基；处理完毕后，用预冷的PBS洗两遍，甲醛固定15分钟，室温结晶紫染色15分钟；轻柔洗去结晶紫溶液，相差显微镜计数细胞数>50的克隆数，计算克隆形成率CFE，CFE指克隆数除以接种细胞数50，用以评价细胞的克隆形成能力。


7.如权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于，所述模型构建方法的流式细胞术检测细胞内ROS含量，取处于对数生长期的HaCaT细胞，按1×105个/孔接种于6孔培养板中，接种24h后，分为UVA模型组和I3C处理组；I3C处理组提前用10μmol/L的I3C处理24h，之后去掉培养基，每孔加入1mlPBS，其中DCFH-DA的浓度为10mol/L，用UVA光源进行照射，剂量分别是：0J/cm2、0.25J/cm2、0.5J/cm2、0.75J/cm2、1J/cm2、1.25J/cm2、1.5J/cm2；照射完毕后，37℃温箱孵育30min后，用真空泵抽去PBS，再用PBS洗涤一次，每孔加入300L胰酶进行消化，消化完毕后，加入400LPBS，反复吹打成细胞悬液，由于DCFH-DA与ROS结合后被激光激发时可发出荧光，用流式细胞仪检测细胞内ROS含量。


8.如权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于，所述模型构建方法的细胞中蛋白Phospho-NF-b、Phos...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱伟，叶兴东，殷花，杨光宇，李文学，张岩，李军涛，杨智聪，
申请(专利权)人：广州市疾病预防控制中心广州市卫生检验中心，广州市食品安全风险监测与评估中心，广州医科大学公共卫生研究院，广州市皮肤病防治所广州市性病防治监测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44