基于PMA-qRT-PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PMA‑qRT‑PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法，将人二倍体细胞和甲型肝炎疫苗孵育后，加入终浓度为50μM的PMA，混匀，2‑8℃避光孵育30min后置于光解仪上光解30min；然后抽提核酸，用qRT‑PCR试剂盒进行定量检测，并以标准品结果绘制回归曲线，以所得结果表示待测样品的病毒滴度。本发明专利技术的检测方法1天即可完成全部实验，极大缩短了检验周期，且具备良好的线性、平行性、灵敏度、重复性、相关性、特异性和适用性，可检测法定方法测定滴度为5.0～8.0lgCCID

【技术实现步骤摘要】
基于PMA-qRT-PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法
本专利技术涉及病毒滴度检测方法，具体涉及一种基于PMA-qRT-PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法。
技术介绍
甲型肝炎病毒(HAV)为小RNA病毒科，肝炎病毒属。基因组由单股正链RNA构成，长度约为7.5kb，包含1个ORF及两端非编码区序列，在5′末端以共价形式连接一个由病毒基因编码的细小蛋白质，称病毒基因组蛋白(VPg)，3’端有Poly(A)尾。HAV是引起甲型病毒性肝炎(甲肝)的主要病原体，主要以人类、猕猴和人猿等灵长类动物为宿主，以粪-口传播为主。HAV在全球范围内均有流行，流行程度与卫生、清洁状况和国家发达程度密切相关。疫苗可有效控制甲肝的爆发和流行，我国已于2008年将儿童接种甲型肝炎疫苗列入国家免疫规划，推动我国甲肝的防控工作。甲型肝炎疫苗包括冻干甲型肝炎减毒活疫苗和甲型肝炎灭活疫苗。其中冻干甲肝减毒活疫苗的主要活性成分为减毒后的HAV。我国选育了两株符合减毒活疫苗生产要求的病毒株H2和L-A-1株，采用人胚肺二倍体细胞(KMB17和2BS细胞株)作为细胞基质，经培养、收获、提取病毒，加入稳定剂冻干制成减毒活疫苗。目前，我国有3家企业生产冻干甲型肝炎减毒活疫苗，分别为浙江普康生物技术股份有限公司(浙江普康)、中国医学科学院医学生物学研究所(昆明所)和长春生物制品研究所有限责任公司(长春所)。甲肝灭活疫苗是采用甲醛灭活的全病毒灭活、纯化疫苗，细胞基质为人胚肺二倍体细胞(KMB17和2BS细胞株)，主要活性成分为HAV抗原，加入氢氧化铝、磷酸铝或者流感血凝素作为佐剂制成的液体疫苗。2002年我国北京科兴生物制品有限公司(北京科兴)采用TZ84株，经病毒提取、纯化、灭活成功研发的甲肝灭活疫苗上市应用。之后，昆明所采用吕8株也成功研发甲型肝炎灭活疫苗。病毒滴度是评价冻干甲型肝炎减毒活疫苗有效性的重要指标，同时也是甲型肝炎灭活疫苗生产工艺中(如收获液阶段)质量控制的关键项目。由于HAV一般不致细胞病变(CPE)，因此HAV病毒滴度不能以CPE的出现和程度为判断依据。《中国药典》2015年版的法定检测方法为细胞培养-ELISA法，可反映疫苗HAV感染性病毒滴度水平。但该方法存在检定周期长(约1个月)、细胞培养量大、操作繁琐和定量准确性较低等问题，成为甲肝疫苗质量控制的关键技术瓶颈，急需建立快速检验甲肝疫苗病毒滴度的方法。有学者采用RT-PCR法检测HAV滴度，该方法具有灵敏度高、特异性好、操作时间短的优点，但不能区分感染性病毒和失活病毒。1994年RicardoL.Chaves建立了链特异性PCR法检测HAV感染性滴度，可特异性检测HAV在复制过程中产生的负链中间体，区分感染性与非感染性病毒。2008年我国学者周健运用细胞培养/链特异性PCR法进行甲肝灭活疫苗的灭活验证试验，结果与传统的ELISA法检测结果相同。2015年夏青娟根据HAV基因组序列设计了5条特异性引物，将甲型肝炎减毒活疫苗感染2BS细胞，收获增殖高峰期的HAV，提取RNA后进行两轮链特异性PCR扩增，检测HAV复制过程中的负链RNA，通过Reed-Muench公式计算HAV感染性滴度。但上述的研究没有对引物进行特异性的实验验证，即无法证明扩增的是负链，而非正链。其研究成果也未有进一步应用进展。黄鑫等人在《感染性病毒PMA联合qPCR定量检测》中解释了叠氮溴化丙锭(PMA)联合qPCR实现活病毒定量的基本原理，并提及PMA的特性，使得它可以和qPCR方法联合使用。PMA能选择性进入失活病毒的衣壳(及包膜)，与病毒的基因组共价结合，抑制其扩增，结合qPCR方法可达到检测及定量活病毒的目的。然而，该文章虽然提及了PMA联合qPCR定量检测在HAV上的应用，但未对甲型肝炎疫苗质量控制评价方面进行阐述。目前暂无采用PMA联合qPCR技术建立疫苗检测方法的报道。本专利技术利用PMA上述特性，与qRT-PCR联合，建立PMA-qRT-PCR法检测甲型肝炎疫苗感染性病毒滴度，可区分甲型肝炎疫苗中衣壳完整的活病毒与衣壳缺损的非感染性病毒，为快速检测甲型肝炎疫苗效力提供新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的细胞培养-ELISA法检测甲肝疫苗病毒滴度工作量大(约1个月)、操作繁琐、检测周期长的缺陷，提供一种快速、有效的甲型肝炎疫苗病毒滴度检测方法，该检测方法具备必要的灵敏度、特异性和准确性。本专利技术的思路是基于PMA能够选择性地进入失活病毒的衣壳(及包膜)与病毒的基因组共价结合，抑制其聚合酶链反应，但无法进入活病毒，从而将衣壳完整的活病毒与衣壳缺损的非感染性病毒区分开。因此，期望通过PMA与qRT-PCR法联用实现甲肝疫苗病毒滴度快速检测。为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于PMA-qRT-PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)将人二倍体细胞用细胞培养瓶培养至单层，然后倒掉多余培养基，向细胞加入PBS缓冲液以清洗细胞表面，然后弃去多余的PBS缓冲液，再加入胰蛋白酶以消化细胞，随后用MEM培养基稀释细胞至0.5-1.0×106个/ml；(2)取甲型肝炎疫苗收获液或成品，为待测样品；(3)取步骤(1)的细胞1.0ml加入1.5ml离心管中，离心处理后弃去上清液；(4)取步骤(2)稀释的待测样品300μl/管加入步骤(3)的细胞中，重悬细胞，37℃震荡孵育2h；(5)向步骤(4)的细胞加入终浓度为25-100μM的PMA，混匀，2-8℃避光孵育30min；然后置于光解仪上光解15-30min；(6)步骤(5)的破碎细胞冻融3次，13000转离心5min使细胞碎片沉淀，取上清50μL，用磁珠法抽提核酸，然后以101～109拷贝/μL梯度稀释的质粒为标准品，用qRT-PCR试剂盒进行定量检测，并以质粒结果绘制回归曲线，以所得结果表示待测样品的甲型肝炎病毒滴度。根据一种优选的实施方式，步骤(2)中，可采用热灭活处理甲型肝炎疫苗收获液或成品，所述热灭活是模拟疫苗在极端温度下主要活性成分HAV病毒失活而导致疫苗效力下降的情况，即将甲型肝炎疫苗收获液或成品置于70℃孵育5min。若采用其他灭活方法处理可能导致样品经PMA处理后无法在后续步骤中获得正确的拷贝数。在本专利技术中，步骤(2)的待测样品pH值为1.48～7.43。作为一种优选实施方式，步骤(5)中，PMA的终浓度为50μM，光解时间为30min。根据一种特别优选的实施方式，步骤(6)qRT-PCR反应中，扩增引物为：P1-P4F：TTTTCAGACTGTTGGGAGTGGP1-P4R：CTGACTGAATCATTTGCTCTTCC其目的片段位置为P1，其探针序列为TTGACCACATCCTG。本专利技术的检测方法可适用于甲型肝炎疫苗病毒滴度。由于专利技术的方法不局限于检测对象的剂型，因此也可用于甲型肝炎疫苗生产过程中如HAV病毒收获液等关键质控环节的病毒滴度检测。...

【技术保护点】
1.基于PMA-qRT-PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法，所述方法包括以下步骤：/n(1)将人二倍体细胞用细胞培养瓶培养至单层，然后倒掉多余培养基，向细胞加入PBS缓冲液以清洗细胞表面，然后弃去多余的PBS缓冲液，再加入胰蛋白酶以消化细胞，随后用MEM培养基稀释细胞至0.5-1.0×10

【技术特征摘要】
1.基于PMA-qRT-PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将人二倍体细胞用细胞培养瓶培养至单层，然后倒掉多余培养基，向细胞加入PBS缓冲液以清洗细胞表面，然后弃去多余的PBS缓冲液，再加入胰蛋白酶以消化细胞，随后用MEM培养基稀释细胞至0.5-1.0×106个/ml；
(2)取甲型肝炎疫苗收获液或成品，为待测样品；
(3)取步骤(1)的细胞1.0ml加入1.5ml离心管中，离心处理后弃去上清液；
(4)取步骤(2)稀释的待测样品300μl/管加入步骤(3)的细胞中，重悬细胞，37℃震荡孵育2h；
(5)向步骤(4)的细胞加入终浓度为25-100μM的PMA，混匀，2-8℃避光孵育30min；然后置于光解仪上光解30min；
(6)步骤(5)的破碎细胞冻融3次，13000转离心5min使细胞碎片沉淀，取上清50μL，用磁珠法抽提核酸，然后以101～...

【专利技术属性】
技术研发人员：卞莲莲，高帆，孙世洋，梁争论，毛群颖，吴星，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11