一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2检测的引物组和试剂盒，属于病毒检测技术领域，所述引物组包括针对orf1a/b片段的引物组和/或针对S基因的引物组；所述针对orf1a/b片段的引物组包括F3‑inside、B3‑inside、FIP‑inside、BIP‑inside、LF‑inside和crRNA‑inside‑R；所述针对S基因的引物组包括S gene‑F3、S gene‑B3、S gene‑FIP、S gene‑BIP、S gene‑LF、S gene‑LB和crRNA‑Sgene‑R；利用本发明专利技术所述引物组和试剂盒进行新型冠状病毒检测，耗时短，成本低，检测灵敏度高，特异性好。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒
本专利技术属于病毒检测
，尤其涉及一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒。
技术介绍
对于此次疫情，国家迅速作出响应，展开一系列防控措施。并在发现病原体后与国际社会共享病毒基因序列信息。随后中国疾病预防控制中心公布了用于SARS-CoV-2荧光PCR检测的引物和探针，荧光PCR方法成为了本次疫情感染确诊方法。但是近几日，越来越多的现场检测反应，荧光PCR方法存在检测假阴性的情况。另外，荧光PCR方法由于操作复杂，需要专业的人士进行检测，并且反应时间较长，现场确诊操作不便和确诊时间延迟。目前的现场快速检测方法主要有胶体金法和等温扩增法。胶体金法检测时间快，操作简单，但是灵敏性和特异性较差。等温扩增法最主要用的是环介导的等温扩增法(LAMP)和重组酶聚合酶等温扩增法(RPA)，LAMP方法灵敏性好，时间短，设备简单，特异性较差，而RPA法的成本较高且专利保护严重，难以在现场大规模应用。相比于传统的分子诊断技术，这两年刚刚专利技术的CRISPR诊断(CRISPR-Dx)技术具有快速、灵敏、特异和成本低等优点。例如，该技术在做传染病检测时，从样本采集到出检测结果只需1小时；其检测灵敏度可达阿摩(attomolar)；其特异性很高，可区分单碱基的差异；检测的试剂成本都很低。因此，CRISPR-Dx也在2018年被美国Science杂志誉为“下一代分子诊断技术”。CRISPR-Dx的优势让其在传染病快检等方向具有非常重要的应用潜力，可应用于医院、海关、CDC以及农业中的动植物、人员检疫等场景。值得一提的是，CRISPR-Dx可与等温扩增技术结合起来，因而不需要复杂的仪器设备；同时，除了报告荧光外，该技术也可以用试纸条来显色，因此使用起来非常简便，也进一步增加了该技术的应用范围，例如各种样本采集现场的快速检测。针对新型冠状病毒，有文献报道以Cas13酶结合RPA技术的检测思路，但是因Cas13酶具有RNA切割活性，操作复杂，需要的CrRNA设计也更长更复杂，RPA试剂价格昂贵，不适应于市场的广泛推广。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于Cas12酶的新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒；所述引物组和试剂盒，结合LAMP技术与Crispr技术，既保证了LAMP技术的时效性，又增加了Crispr技术的高特异性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组，包括针对orf1a/b片段的引物组和/或针对S基因的引物组；所述针对orf1a/b片段的引物组包括F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R；所述F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R的核苷酸序列依次如SEQIDNo.1～SEQIDNo.6所示；所述针对S基因的引物组包括Sgene-F3、Sgene-B3、Sgene-FIP、Sgene-BIP、Sgene-LF、Sgene-LB和crRNA-Sgene-R；所述Sgene-F3、Sgene-B3、Sgene-FIP、Sgene-BIP、Sgene-LF、Sgene-LB和crRNA-Sgene-R的核苷酸序列依次如SEQIDNo.7～SEQIDNo.13所示。优选的，所述FIP-inside、BIP-inside、Sgene-FIP和Sgene-BIP的使用浓度独立为1.5～1.7μmol/L；所述F3-inside、B3-inside、Sgene-F3和Sgene-B3的使用浓度独立为0.15～0.25μmol/L；所述LF-inside、Sgene-LF和Sgene-LB的使用浓度独立为0.35～0.45μmol/L。本专利技术提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的试剂盒，包括所述的引物组。优选的，所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增试剂和Crispr检测试剂。优选的，所述LAMP扩增试剂包括LAMPMixture、LAMPdye和dUTP。优选的，所述T7-crRNA-F的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。优选的，所述Crispr检测试剂包括crRNA-inside-R、crRNA-Sgene-R、T7-crRNA-F、Cas12a酶和HEX-N12-BHQ1。优选的，所述crRNA的使用浓度为8～12μmmol/L。优选的，所述Cas12a酶的使用浓度为250～500nmol/L。优选的，所述HEX-N12-BHQ1的使用浓度为8～12μmmol/L。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒；将LAMP技术与Crispr技术相结合，既保证了LAMP技术的时效性，又增加了Crispr技术的高特异性；利用本专利技术所述的试剂盒进行新型冠状病毒检测，耗时短，成本低，设备需求简单，检测灵敏度高，特异性好，能够显著减少假阴性；本专利技术所述试剂盒检测灵敏度能够达到100copies/反应，与现在通用的荧光PCR方法相比处于同一数量级，但是特异性高于荧光PCR，反应时间比荧光PCR少一半。采用临床样本进行检测，本专利技术所述的试剂盒检测结果与荧光PCR检测结果相比，准确率达到100％。附图说明图1为新型冠状病毒的基因序列与其他近源序列对比结果；图2为以包括orf1a/b片段的质粒为模板，RT-LAMP灵敏度检测的结果；图3为以包括S基因的质粒为模板，RT-LAMP灵敏度检测的结果；图4为以包括orf1a/b片段的质粒及新型冠状病毒能力验证样本、其他病毒样本为模板，RT-LAMP特异性检测的结果；图5为以包括S基因的质粒及新型冠状病毒能力验证样本、其他病毒样本为模板，RT-LAMP特异性检测的结果。具体实施方式本专利技术提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组，包括针对orf1a/b片段的引物组和/或针对S基因的引物组；所述针对orf1a/b片段的引物组包括F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R；所述F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R的核苷酸序列依次如SEQIDNo.1～SEQIDNo.6所示；所述针对S基因的引物组包括Sgene-F3、Sgene-B3、Sgene-FIP、Sgene-BIP、Sgene-LF、Sgene-LB和crRNA-Sgene-R；所述Sgene-F3、Sgene-B3、Sgene-FIP、Sgene-BIP、S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组，其特征在于，包括针对orf1a/b片段的引物组和/或针对S基因的引物组；/n所述针对orf1a/b片段的引物组包括F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R；所述F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示；/n所述针对S基因的引物组包括S gene-F3、S gene-B3、S gene-FIP、S gene-BIP、Sgene-LF、S gene-LB和crRNA-Sgene-R；所述S gene-F3、S gene-B3、S gene-FIP、S gene-BIP、S gene-LF、S gene-LB和crRNA-Sgene-R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.7～SEQ IDNo.13所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组，其特征在于，包括针对orf1a/b片段的引物组和/或针对S基因的引物组；
所述针对orf1a/b片段的引物组包括F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R；所述F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R的核苷酸序列依次如SEQIDNo.1～SEQIDNo.6所示；
所述针对S基因的引物组包括Sgene-F3、Sgene-B3、Sgene-FIP、Sgene-BIP、Sgene-LF、Sgene-LB和crRNA-Sgene-R；所述Sgene-F3、Sgene-B3、Sgene-FIP、Sgene-BIP、Sgene-LF、Sgene-LB和crRNA-Sgene-R的核苷酸序列依次如SEQIDNo.7～SEQIDNo.13所示。


2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述FIP-inside、BIP-inside、Sgene-FIP和Sgene-BIP的使用浓度独立为1.5～1.7μmol/L；所述F3-inside、B3-inside、Sgene-F3和Sgene-B3的使用浓度独立为0.15～0.25μmol/L；所述LF-i...

【专利技术属性】
技术研发人员：张子龙，田桢干，张威，李深伟，张晓航，杜鹃，张宏，陆晔，
申请(专利权)人：上海国际旅行卫生保健中心上海海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：上海;31