鉴定新型冠状病毒的引物探针及在双重数字PCR的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种筛查鉴定新型冠状病毒(SARS‑CoV2)以及其他类SARS冠状病毒的双重数字PCR引物、探针、鉴定方法以及鉴定试剂盒。根据SARS‑CoV2病毒的S基因序列特异区域(与其他类SARS病毒均不同)设计第一套引物、探针(标记为FAM)，根据类SARS病毒保守区域E基因序列设计第二套引物、探针(标记为HEX)，本发明专利技术克服了目前WHO以及国家CDC推荐的新型冠状病毒确诊所用qPCR核酸检测方法假阳性率高的缺点，具有敏感度高、可精确定量以及有效区分新型冠状病毒和其他类SARS病毒的优点，可满足新型冠状病毒以及其他类SARS病毒的精准分子鉴定需求。

【技术实现步骤摘要】
鉴定新型冠状病毒的引物探针及在双重数字PCR的用途
本专利技术属于应用生物
，具体涉及筛查鉴定新型冠状病毒以及其他类SARS冠状病毒的特异性筛查鉴定引物、探针、鉴定方法及鉴定试剂盒。
技术介绍
目前国家CDC和WHO均推荐了荧光定量PCR作为新型冠状病毒(SARS-CoV2)确诊方法，然而，实际临床应用过程中发现大量假阴性结果，除了病毒RNA核酸提取方法、取样部位以及保存不当导致核酸降解等因素外，荧光PCR方法本身的问题无法忽视。相比荧光定量PCR，数字PCR具有敏感度高、可精确定量的优势；此外，目前尚没有方法可同时鉴定区分新型冠状病毒与其他类SARS病毒，这对疫病防控及筛查其他类似疫病有重大意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，所述的引物和探针包括正向引物NCS-F、反向引物NCS-R和探针序列NCS-P；所述正向引物NCS-F的序列为：5’TGGTGCAGGTATATGCGCTA3’；所述反向引物NCS-R的序列为：5’GTGACATAGTGTAGGCAATGATG3’；所述探针序列NCS-P的序列为：5’AGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGG-3’。在一个实施方案中，所述用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针还包括正向引物NCE-F、反向引物NCE-R和探针序列NCE-P；所述正向引物NCE-F的序列为：5’AGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTAC3’；所述反向引物NCE-R的序列为：5’CAATATTGCAGCAGTACGCACA3’；所述探针序列NCE-P的序列为：5’CACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGA-3。在一个实施方式中，所述探针序列NCS-P的一个末端具有第一荧光报告基团，另一个末端具有第一荧光淬灭基团；所述探针序列NCE-P的一个末端具有第二荧光报告基团，另一个末端具有第二荧光淬灭基团。在一个实施方式中，所述第一荧光报告基团和第二荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、CY5或ROX；所述第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、Eclipse或TAMRA。优选的，所述第一荧光报告基团置于探针序列NCS-P的5’端，所述第一荧光淬灭基团置于探针序列NCS-P的3’端；所述第二荧光报告基团置于探针序列NCE-P的5’端，所述第二荧光淬灭基团置于探针序列NCE-P的3’端。在优选的实施方式中，所述第一荧光报告基团和第二荧光报告基团是不同的；优选的，第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为HEX。另一方面，本专利技术还提供了上述引物和探针在鉴定SARS-Cov2病毒以及非SARS-Cov2冠状病毒中的应用。进一步的，上述应用包括利用正向引物NCS-F、反向引物NCS-R、探针序列NCS-P以及正向引物NCE-F、反向引物NCE-R、探针序列NCE-P对待测样本进行双重数字PCR；当第一荧光报告基团和第二荧光报告基团均为阳性时，待测样本为SARS-Cov2病毒；当第一荧光报告基团为阴性、第二荧光报告基团为阳性时，待测样本为非SARS-Cov2冠状病毒；当第一荧光报告基团和第二荧光报告基团均为阴性时，待测样本非冠状病毒。另一方面，本专利技术还提供了上述引物和探针在制备鉴定SARS-Cov2病毒以及非SARS-Cov2冠状病毒的试剂盒中的用途。进一步的，上述试剂盒为双重数字PCR反应试剂盒。进一步的，可以根据反应结果判断待测样本的类型；具体而言，当第一荧光报告基团和第二荧光报告基团均为阳性时，待测样本为SARS-Cov2病毒；当第一荧光报告基团为阴性、第二荧光报告基团为阳性时，待测样本为非SARS-Cov2冠状病毒；当第一荧光报告基团和第二荧光报告基团均为阴性时，待测样本非冠状病毒。进一步的，上述非SARS-Cov2冠状病毒包括SARS病毒、MERS病毒。本专利技术提供的鉴定新型冠状病毒(SARS-Cov2)的引物和探针，检测灵敏度低，通过一个双重数字PCR反应即可区分鉴别新型冠状病毒、除SARS-Cov2病毒外的其他类SARS病毒，以及其他非相关病原，具有广泛的应用前景。附图说明图1.双重数字PCR检测鉴定新型冠状病毒敏感度试验。从左至右，共8孔，分别是1：107copies/reaction(包括E基因和S基因)；2：106copies/reaction；3：105copies/reaction；4：104copies/reaction；5：103copies/reaction；6：102copies/reaction；7：101copies/reaction；8：Negativecontrol.图2.双重微滴式数字PCR检测鉴定新型冠状病毒特异性试验。Ch1为FAM荧光信号，Ch2为HEX荧光信号。从左至右，共8孔，分别是1：PEDV病毒核酸；2：TGEV病毒核酸；3：PPRV病毒核酸；4：FMDV病毒核酸；5：RV病毒核酸；6：PPV病毒核酸；7：阴性对照；8：阳性对照(nCov-cDNA)。图3.双重微滴式数字PCR鉴定检测不同SARS病毒结果。从左至右，共4孔，从左至右依次是，新型冠状病毒，模拟SARS病毒核酸，PEDV病毒，阴性对照。图4.双重微滴式数字PCR临床样本检测结果。Ch1为FAM荧光信号，Ch2为HEX荧光信号。从左至右，共7孔，分别是1：临床样本2011；2：临床样本2012；3：临床样本2013；4：临床样本2014；5：临床样本2015；6：临床样本2016；7：阳性对照(nCov-cDNA)。实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。1、引物、探针序列的获得及阳性质粒的构建根据新型冠状病毒(SARS-CoV2)全长核酸序列，进行比对分析，并与SARS病毒、类SARS病毒的全长序列做比对，找出SARS-CoV2病毒特异性序列S基因，类SARS病毒保守序列E基因，然后根据上述序列设计引物、探针。所涉及引物探针如下：本实施例通过构建标准质粒完成数字PCR方法的敏感性检验。根据SARS-CoV2的E基因以及S基因全长序列，以pUC57质粒为基础，合成E基因及S基因全长并构建重组质粒。使用热激法转入大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞内，涂布平板挑选单克隆菌落，将菌落扩繁培养并取菌液提取质粒。在应用Nanodrop定量后，计算质粒浓度，然后分别稀释为5×106copies/μl，5×105copi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，所述的引物和探针包括正向引物NCS-F、反向引物NCS-R和探针序列NCS-P，其特征在于，/n所述正向引物NCS-F的序列为：/n5’TGGTGCAGGTATATGCGCTA3’；/n所述反向引物NCS-R的序列为：/n5’GTGACATAGTGTAGGCAATGATG3’；/n所述探针序列NCS-P的序列为：/n5’AGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，所述的引物和探针包括正向引物NCS-F、反向引物NCS-R和探针序列NCS-P，其特征在于，
所述正向引物NCS-F的序列为：
5’TGGTGCAGGTATATGCGCTA3’；
所述反向引物NCS-R的序列为：
5’GTGACATAGTGTAGGCAATGATG3’；
所述探针序列NCS-P的序列为：
5’AGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGG-3’。


2.根据权利要求1所述的用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，其特征在于，还包括正向引物NCE-F、反向引物NCE-R和探针序列NCE-P；
所述正向引物NCE-F的序列为：
5’AGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTAC3’；
所述反向引物NCE-R的序列为：
5’CAATATTGCAGCAGTACGCACA3’；
所述探针序列NCE-P的序列为：
5’CACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGA-3。


3.根据权利要求1或2所述的用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，其特征在于，所述探针序列NCS-P的一个末端具有第一荧光报告基团，另一个末端具有第一荧光淬灭基团；所述探针序列NCE-P的一个末端具有第二荧光报告基团，另一个末端具有第二荧光淬灭基团。


4.根据权利要求3所述的用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，其特征在于，所述第一荧光报告基团和第二荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、CY5或ROX；所述第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕继洲，林祥梅，吴绍强，袁向芬，张舟，邓俊花，冯春燕，王彩霞，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11