一种提高农杆菌介导的植物遗传转化效率的方法技术

本发明专利技术在现有的农杆菌介导的遗传转化方法的基础之上进行改进，获得了一种提高农杆菌介导的植物遗传转化的效率的重组载体，含有该重组载体的改造农杆菌，以及采用该改造农杆菌来介导植物遗传转化的方法，该方法可以显著提高植物遗传转化效率，可以应用于植物转基因技术中，特别是应用于诸如小麦、马铃薯等转化困难的植物。

【技术实现步骤摘要】
一种提高农杆菌介导的植物遗传转化效率的方法
本专利技术涉及一种提高农杆菌介导的植物遗传转化的效率的重组载体，含有该重组载体的改造农杆菌，以及采用该改造农杆菌来介导植物遗传转化的方法，属于农作物生物

技术介绍
小麦是禾本科(Gramineae)小麦属(Tritucum)的一年生或多年生草本植物，是世界上种植最广泛、总产量最高的粮食作物之一。小麦营养价值高，籽粒富含糖类、蛋白质和脂肪，具有很高的研究价值(Tosietal.,2009；Godfrayetal.,2010)。在农作物领域，转基因技术应用较多。简单来说，利用组织培养技术和基因重组技术引入其他生物或物种的基因来培育转基因农作物(也称基因重组农作物)。现有技术中，通常采用转基因技术来改良农作物的品质，诸如防病和抗逆等等，大幅提高了农作物的产量与品质，同时减少了化学农药的使用，对环境友好。农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化法、基因枪法和花粉管通道法是植物转化中最常规的方法，尤其是农杆菌介导的遗传转化法备受本领域技术人员喜爱，它的主要优点是整合到植物染色体中的基因大多是低拷贝的，也可以插入相对较大的外源DNA片段(大于10kb)以及所得到的转基因植物具有更高的质量性状和繁殖能力，可以获得稳定的遗传后代，因此，在农作物的遗传转化中，农杆菌介导的转化法被广泛应用。相较于棉花、玉米和水稻等农作物，小麦在转基因方面的技术明显处于比较滞后的状态，主要是因为小麦的遗传转化比较困难，遗传转化效率比较低，重复性比较差。最近几年，日本烟草公司开发的商业化PureIntro专利技术(Ishidaetal.,2015)，在小麦遗传转化体系中取得成功，对于部分小麦品种显著提高了转化效率。但是使用该专利费用昂贵，暂时无法在我国进行应用推广。除了小麦以外，在农作物领域，还有诸如马铃薯等很多农作物的遗传转化也很困难。因此，本领域技术人员希望在现有的农杆菌介导的遗传转化方法的基础之上进行改进，获得提高植物遗传转化效率的方法和工具。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术一方面提供了一种提高农杆菌介导的植物遗传转化的效率的重组载体，其中，所述重组载体是在农杆菌的蛋白表达质粒中插入AtVIP1基因的表达盒而获得的，所述农杆菌的蛋白表达质粒具有农杆菌-大肠杆菌穿梭功能；所述AtVIP1基因的表达盒，从5’端到3’端，依次包括virB操纵子所对应的启动子pvirB序列，AtVIP1基因的编码序列和转运标签蛋白的编码序列；所述AtVIP1基因为来源于拟南芥的AtVIP1基因；所述转运标签蛋白的编码序列能够在所述农杆菌中表达转运标签蛋白，所述转运标签蛋白能够被所述农杆菌的T4SS转运体系识别，从而使得所述AtVIP1基因的表达盒所表达的蛋白能够被转运至植物细胞质。优选的，所述转运标签蛋白的编码序列为截短的VirF蛋白编码序列，且其编码的转运标签蛋白与VirF蛋白相比，N端缺失42个氨基酸。优选的，所述AtVIP1基因的表达盒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；或者，所述AtVIP1基因的表达盒的核苷酸序列能够在严格条件下与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交且编码具有相同功能的多肽。优选的，所述农杆菌的蛋白表达质粒为p302b、pBIN或pPZP质粒。本专利技术另一方面提供了一种提高植物遗传转化的效率的改造农杆菌，其中，所述改造农杆菌中含有如上述的提高农杆菌介导的植物遗传转化的效率的重组载体。本专利技术还一方面提供了一种农杆菌介导的植物遗传转化方法，该方法是通过农杆菌介导的方式将外源核酸分子导入到植物基因组中，其中，该方法包括以下步骤：步骤1)：获取如上述的提高植物遗传转化的效率的改造农杆菌；步骤2)：获取含有所述外源核酸分子的微型Ti质粒，并将其转入步骤1)获取的所述改造农杆菌中，获得含有所述微型Ti质粒的第二改造农杆菌；步骤3)：将步骤2)获得的所述第二改造农杆菌侵染特定的植物细胞，所述特定的植物细胞能够再生为完整植株。优选的，所述植物为小麦或马铃薯。本专利技术还一方面提供了一种农杆菌介导的外源基因在植物组织中的瞬时表达及检测方法，其中，该方法包括以下步骤：步骤a)：获取如上述的提高植物遗传转化的效率的改造农杆菌；步骤b)：获取含有所述外源基因的微型Ti质粒，并将其转入步骤a)获取的所述改造农杆菌中，获得含有所述微型Ti质粒的第二改造农杆菌；步骤c)：将步骤b)获得的所述第二改造农杆菌侵染植物的根系和/或叶片组织；步骤d)：在短时间内对步骤c)获得的侵染组织进行外源基因的表达情况检测。优选的，所述植物为小麦或马铃薯。本专利技术在现有的农杆菌介导的遗传转化方法的基础之上进行改进，获得了一种提高农杆菌介导的植物遗传转化的效率的重组载体以及含有该重组载体的改造农杆菌，它们可以显著提高植物遗传转化效率，可以应用于植物转基因技术中，特别是应用于诸如小麦、马铃薯等转化困难的植物。附图说明图1，应用例1中，采用本专利技术的改造农杆菌(EHA105:pV1F菌株)介导的外源基因在小麦叶片组织中的瞬时表达的检测结果；图2，应用例2中，采用本专利技术的改造农杆菌(EHA105:pV1F菌株)介导的外源基因在马铃薯叶片组织中的瞬时表达的检测结果。具体实施方式在本专利技术的一个具体实施方案中，提供了一种提高农杆菌介导的植物遗传转化的效率的重组载体，其中，所述重组载体是在农杆菌的蛋白表达质粒中插入AtVIP1基因的表达盒而获得的，所述农杆菌的蛋白表达质粒具有农杆菌-大肠杆菌穿梭功能；所述AtVIP1基因的表达盒，从5’端到3’端，依次包括virB操纵子所对应的启动子pvirB序列，AtVIP1基因的编码序列和转运标签蛋白的编码序列；所述AtVIP1基因为来源于拟南芥的AtVIP1基因；所述转运标签蛋白的编码序列能够在所述农杆菌中表达转运标签蛋白，所述转运标签蛋白能够被所述农杆菌的T4SS转运体系识别，从而使得所述AtVIP1基因的表达盒所表达的蛋白能够被转运至植物细胞质。本专利技术的专利技术人希望能够在现有的农杆菌介导的遗传转化方法的基础之上进行改进，获得提高植物遗传转化效率的方法和工具，并且应用于诸如小麦、马铃薯等转化困难的植物。现有技术中，本领域技术人员发现了在烟草中过表达拟南芥的AtVIP1基因能够提高农杆菌的转化效率，并在此基础上进行了一些研发和应用。目前，常规的方法是先将拟南芥的AtVIP1基因通过农杆菌转入到植物中，使得AtVIP1基因能够在植物中进行表达(或过量表达)，然后再通过农杆菌将外源核酸分子转入到植物中；之前在植物中表达(或过量表达)的AtVIP1蛋白能够提高外源核酸分子转入到植物中的遗传转化效率，例如，在烟草中过表达拟南芥的VIP1基因能够提高农杆菌介导的遗传转化效率。但是，这本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高农杆菌介导的植物遗传转化的效率的重组载体，其特征在于：所述重组载体是在农杆菌的蛋白表达质粒中插入AtVIP1基因的表达盒而获得的，/n所述农杆菌的蛋白表达质粒具有农杆菌-大肠杆菌穿梭功能；/n所述AtVIP1基因的表达盒，从5’端到3’端，依次包括virB操纵子所对应的启动子pvirB序列，AtVIP1基因的编码序列和转运标签蛋白的编码序列；/n所述AtVIP1基因为来源于拟南芥的AtVIP1基因；/n所述转运标签蛋白的编码序列能够在所述农杆菌中表达转运标签蛋白，所述转运标签蛋白能够被所述农杆菌的T4SS转运体系识别，从而使得所述AtVIP1基因的表达盒所表达的蛋白能够被转运至植物细胞质。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高农杆菌介导的植物遗传转化的效率的重组载体，其特征在于：所述重组载体是在农杆菌的蛋白表达质粒中插入AtVIP1基因的表达盒而获得的，
所述农杆菌的蛋白表达质粒具有农杆菌-大肠杆菌穿梭功能；
所述AtVIP1基因的表达盒，从5’端到3’端，依次包括virB操纵子所对应的启动子pvirB序列，AtVIP1基因的编码序列和转运标签蛋白的编码序列；
所述AtVIP1基因为来源于拟南芥的AtVIP1基因；
所述转运标签蛋白的编码序列能够在所述农杆菌中表达转运标签蛋白，所述转运标签蛋白能够被所述农杆菌的T4SS转运体系识别，从而使得所述AtVIP1基因的表达盒所表达的蛋白能够被转运至植物细胞质。


2.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：
所述转运标签蛋白的编码序列为截短的VirF蛋白编码序列，且其编码的转运标签蛋白与VirF蛋白相比，N端缺失42个氨基酸。


3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：
所述AtVIP1基因的表达盒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；或者，所述AtVIP1基因的表达盒的核苷酸序列能够在严格条件下与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交且编码具有相同功能的多肽。


4.如权利要求1至3中任意一项所述的重组载体，其特征在于：
所述农杆菌的蛋白表达质粒为p302b、pBIN或pPZP质粒。


5.一种提高植物遗传转化的效率的改造...

【专利技术属性】
技术研发人员：王路遥，司方洁，杨丙烨，桂颖，
申请(专利权)人：中国农业科学院深圳农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44