一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法技术

本发明专利技术提供了一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法，将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，后，再在优化培养基M13上诱导外植体长愈伤，即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。该转化方法与传统番木瓜转化相比，直接使用预培养的下胚轴作为外植体，避免了愈伤诱导后扩繁的4‑5个月时间，显著缩短转化周期。本发明专利技术所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法
本专利技术涉及植物基因工程
，尤其涉及一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法。
技术介绍
番木瓜是一种主要的热带水果，也是鲜果市场上的主要供应水果。番木瓜同时也被加工成饮料、果酱、干果和甜点，其青果、叶片和花也可以作为蔬菜(Watson,1997)。目前番木瓜的育种主要采用传统育种，由于制约着番木瓜的生产的主要为番木瓜环斑型花叶病毒病，我们用常规杂交方法难以赋予番木瓜栽培品种以野生番木瓜中的抗性特性，提高番木瓜产量，改良番木瓜品质仍是当前重要任务。我们通过转基因技术可以定向的改变植物的抗性，产量，品质等方面。但是由于现有的转基因方法中番木瓜诱导愈伤组织的周期很长，并且体系不是特别稳定，严重制约着番木瓜育种产业的发展。因此建立一种简单高效的番木瓜转基因方法，对番木瓜分子育种及基因功能研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法，可以有效解决上述问题。本专利技术是这样实现的：本专利技术提供一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，再移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，将苗的下胚轴经伤口膨大处理即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。作为进一步改进的，所述消毒为在无菌环境中，将番木瓜种子先后经过体积浓度为70～80％的酒精、体积浓度为3～4％的NaClO溶液和质量浓度为0.05～0.15％氯化汞消毒，用无菌水清洗数次，这种消毒方式显著抑制了木瓜内生菌的繁殖。作为进一步改进的，所述浸泡为将番木瓜种子浸泡在体积浓度为18～22％的NaClO溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床3.5～4.5h；然后将番木瓜种子从NaClO溶液中取出，用无菌水清洗数次，浸泡在浓度为0.5～1.5mol/L的KNO3溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床20～26h，番木瓜种子经过KNO3的处理，显著提高了种子的萌发率。作为进一步改进的，所述抗生素为浓度为450～550mg/L的羧苄青霉素。作为进一步改进的，所述萌发长芽为将番木瓜种子从KNO3溶液中取出，用无菌水清洗数次，放入含有抗生素的无菌水中，置于28～32℃，110～130rpm摇床，每天更换含有抗生素的无菌水，直至番木瓜种子出芽，这种方法保证了种子萌发过程中不被污染。作为进一步改进的，所述伤口膨大处理为当待黑暗生长的苗高度达8～10cm，顶端的两片子叶张开时，取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上培养5～7天，伤口膨大处理对于转化的成功，转化后诱导愈伤的形成非常关键。作为进一步改进的，所述K4培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L。作为进一步改进的，所述M13培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH6.0～6.2，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L，脯氨酸对于显著缩短愈伤生长周期具有重要作用。本专利技术还提供一种应用上述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的农杆菌介导的转化方法，包括以下步骤：S1：在无菌环境中，用含有目的基因的农杆菌的侵染液侵染所述番木瓜下胚轴农杆菌转化受体，吹干；S2：将侵染过的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体转移至k4培养基上加无菌滤纸共培22～26小时，吹干，置于k4+T培养基上培养32天后，转移至M13+T培养基中共抑菌培养2～3个月，诱导外植体长愈伤随后出芽，每月更换新的M13+T培养基，直至不再出芽为止；S3：将步骤S2中长出的芽挑出，转接至MBNT培养基上置于光照下恢复培养20～30天，接下来置于MBNTH培养基上光照下培养3个月，筛选存活下来的绿芽；S4：将步骤S3中筛选的绿芽转接至MBNT培养基中继续培养，每月更换一次新培养基，待绿芽长成2～2.5cm高的幼苗时，将幼苗从基部切掉，放入Rooting培养基中，培养3～5周进行生根；S5：将步骤S4中生根的幼苗进行PCR和Southern鉴定；S6：将步骤S4得到的阳性幼苗转移至蛭石+1/2MS培养基中，液体的1/2MS培养基浸湿蛭石即可，培养7天，观察有细根和根毛长出时，放入培养土中，于培养箱里光照培养，待苗生长的健壮，即可转移至大棚。作为进一步改进的，所述k4培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L；k4+T培养基为所述k4培养基中加入特美汀200mg/L；所述M13+T的培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH6.0～6.2，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L，特美汀100mg/L；所述MBNTH培养基为：MS4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH5.8左右，高压灭菌后加6BA0.2mg/L，NAA0.2mg/L，特美汀100mg/L，潮霉素50mg/L；所述MBNT培养基即MBNTH培养基不加潮霉素其他不变的培养基；所述Rooting培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH5.5～6.0，高压灭菌后加IBA0.2mg/L。作为进一步改进的，所述侵染液含有农杆菌的OD600值为0.05～0.08。本专利技术的有益效果是：本专利技术直接利用番木瓜下胚轴作为外植体直接转化后再诱导愈伤分化出芽，长出的芽经过抗性筛选最终筛选到转基因植株。这种方式避免了愈伤组织的四到五个月的扩繁时间，显著缩短了转化周期。本专利技术所提供的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法及番木瓜农杆菌介导的转化方法，外植体的获得操作简单易行，愈伤组织诱导所需培养基简单高效，目的基因转化周期短，效率高，这个方法的应用为研究番木瓜基因功能、发掘有益基因并应用于育种具有非常重要的价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1是本专利技术实施例的番木瓜种子萌发长芽的图。图2是本专利技术实施例的切好后放置于K4培养基上的番木瓜下胚轴的图。图3是本专利技术实施例的转到M13+T培养基上的番木瓜下胚轴的图。图4是本专利技术实施例的农杆菌侵染后在MBNTH培养基上挑出的抗性绿芽的图。图5是本专利技术实施例的筛选出的抗性绿芽长大成苗的图。图6是本专利技术实施例的目的基因35s-CpYh-1以35s-CpYh-1F/R为引物的扩增图。其中，1,2泳道为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，再移植到琼脂培养基中在黑暗的条件下培养至长苗，将苗的下胚轴经伤口膨大处理，即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。/n

【技术特征摘要】
1.一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，再移植到琼脂培养基中在黑暗的条件下培养至长苗，将苗的下胚轴经伤口膨大处理，即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。


2.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述消毒为在无菌环境中，将番木瓜种子先后经过体积浓度为70～80％的酒精、体积浓度为3～4％的NaClO溶液和质量浓度为0.05～0.15％氯化汞消毒，用无菌水清洗数次。


3.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述浸泡为将番木瓜种子浸泡在体积浓度为18～22％的NaClO溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床3.5～4.5h；然后将番木瓜种子从NaClO溶液中取出，用无菌水清洗数次，浸泡在浓度为0.5～1.5mol/L的KNO3溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床20～26h。


4.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述抗生素为浓度为450～550mg/L的羧苄青霉素。


5.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述萌发长芽为将番木瓜种子从KNO3溶液中取出，用无菌水清洗数次，放入含有抗生素的无菌水中，置于28～32℃，110～130rpm摇床，每天更换含有抗生素的无菌水，直至番木瓜种子出芽。


6.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述伤口膨大处理为当待长出的苗的高度达8～10cm，顶端的两片子叶张开时，取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上培养5～7天。


7.根据权利要求6所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述K4培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L。


8.一种应用权利要求1至7所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的农杆菌介导的转化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：在无菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳晶晶，刘娟，明瑞光，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35