一种河北杨遗传转化方法技术

本发明专利技术涉及一种河北杨遗传转化方法，通过采用无菌苗叶片作为外植体进行遗传转化，它不通过诱导愈伤组织阶段而直接诱导不定芽，即省略了复杂的培养程序，又缩短了培养周期，其通过利用农杆菌介导法，建立河北杨高效遗传转化体系，培育杨树新品种，并可对相关基因进行功能研究，对于进一步建立基因功能快速验证体系具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种河北杨遗传转化方法
本专利技术属于转基因工程
，具体涉及一种以叶片为受体农杆菌介导的河北杨遗传转化方法。
技术介绍
河北杨(PopulushopeiensisHuetChow)是杨柳科杨属乔木，高达30m。树皮黄绿色至灰白色，光滑，树冠圆大。叶卵形或近圆形，长3-8cm，宽2-7cm。雄花序长约5cm，花序轴被密毛，雌花序长3-5cm。蒴果长卵形，有短柄。花期4月，果期5-6月。其主要分布于中国华北、西北各省区，为河北省山区常见杨树之一，各地有栽培，多生长于海拔700～1600m的河流两岸、沟谷阴坡及冲积阶地上。河北杨木材可供建筑、农具、箱板等用，做蒸笼材更为合适，为华北、西北黄土丘陵峁顶、梁坡、沟谷及沙滩地的水土保持或用材林造林树种，也是庭院、行道优良树种。目前河北杨转基因研究普遍以叶盘为受体材料的农杆菌介导的遗传转化方法，但其遗传转化条件难以统一，转化效率不高，影响通过转基因改良河北杨遗传特征的研究。并且一般必须要经过诱导愈伤组织阶段，培养程序复杂，培养周期较长，不利于快速和大规模进行遗传转化。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有河北杨遗传转化中存在培养程序复杂、培养周期较长等技术不足，提供了一种河北杨遗传转化的方法，通过采用无菌苗叶片为外植体与农杆菌共培养的方法进行遗传转化，简化培养程序，缩短培养时间，为杨属的遗传转化、品质改良和基因功能验证提供了一个新途径。为实现上述目的，本专利技术提供了一种河北杨遗传转化方法，所述河北杨遗传转化方法包括如下步骤：>(1)以河北杨无菌苗2～6叶片为外植体，沿主脉均匀划伤数道后，远轴面朝上接种于D培养基上暗处预培养1d；其中，所述D培养基为MS+TDZ0.30mg/L+IBA0.40mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.95～5.98；(2)从-80℃冰箱取出保存的农杆菌菌种，用无菌枪头蘸取菌种保存液，在附加50mg/L-kan和25mg/LRif的固体培养基上划板，将平板倒置放入28℃温箱中，暗培养3d至单菌落产生，之后挑取农杆菌单菌落接种于附加抗生素的5mLLB液体培养基中，在恒温摇床上培养24h，之后吸取300μL农杆菌单菌落培养液并将其转接至附加抗生素的50mLLB液体培养基中振荡培养至OD600为0.6，得到侵染菌液；(3)将经步骤(1)预培养处理后的叶片浸入步骤(2)的侵染菌液中，振荡侵染10min，取出叶片放到无菌滤纸上吸取多余的菌液，接种于D培养基上，在25℃下的暗处共培养3d；(4)对共培养后的叶片用无菌滤纸吸取农杆菌，转移到不定芽诱导选择培养基F上培养，每隔15d换一次新的培养基直到分化出抗性芽，其中，所述培养基F为MS+TDZ0.30mg/L+IBA0.40mg/L+HygB3.0mg/L+Tim400mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.95～5.98；(5)当步骤(4)所述的抗性芽长度达到1cm左右时，接种于生根选择培养基H中进行培养，所述培养基H为1/2MS+IBA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+HygB3.0mg/L+Tim400mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.95～5.98。优选地，所述步骤(2)中恒温摇床的培养温度为28℃，转速为180r/min。优选地，所述步骤(5)中培养温度为25±1℃、光照强度为2500Lx，光照时间12h/d。基于上述技术方案，本专利技术的优点是：本专利技术的河北杨遗传转化方法采用无菌苗叶片作为外植体进行遗传转化，它不通过诱导愈伤组织阶段而直接诱导不定芽，即省略了复杂的培养程序，又缩短了培养周期，其通过利用农杆菌介导法，建立河北杨高效遗传转化体系，培育杨树新品种，并可对相关基因进行功能研究，对于进一步建立基因功能快速验证体系具有重要意义。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为把叶片OD600＝0.6的菌液中侵染10min后的共培养图；图2为选择培养图；图3为抗性芽再生图；图4为抗性芽PCR技术检测图。具体实施方式下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。本专利技术提供了一种河北杨遗传转化方法，如图1～图4所示，其中示出了本专利技术的一种优选实施方式。具体地，所述河北杨遗传转化方法包括如下步骤：(1)以河北杨无菌苗2～6叶片为外植体，沿主脉均匀划伤数道后，远轴面朝上接种于D培养基上暗处预培养1d；其中，所述D培养基为MS+TDZ0.30mg/L+IBA0.40mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.95～5.98。(2)从-80℃冰箱取出保存的农杆菌菌种，用无菌枪头蘸取菌种保存液，在附加50mg/L-kan和25mg/LRif的固体培养基上划板，将平板倒置放入28℃温箱中，暗培养3d至单菌落产生，之后挑取农杆菌单菌落接种于附加抗生素的5mLLB液体培养基中，在恒温摇床上培养24h，之后吸取300μL农杆菌单菌落培养液并将其转接至附加抗生素的50mLLB液体培养基中振荡培养至OD600为0.6，得到侵染菌液。优选地，所述步骤(2)中恒温摇床的培养温度为28℃，转速为180r/min。(3)将经步骤(1)预培养处理后的叶片浸入步骤(2)的侵染菌液中，振荡侵染10min，取出叶片放到无菌滤纸上吸取多余的菌液，接种于D培养基上，在25℃下的暗处共培养3d。(4)对共培养后的叶片用无菌滤纸吸取农杆菌，转移到不定芽诱导选择培养基F上培养，每隔15d换一次新的培养基直到分化出抗性芽，其中，所述培养基F为MS+TDZ0.30mg/L+IBA0.40mg/L+HygB3.0mg/L+Tim400mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.95～5.98。一般培养30～45d后产生不定芽。采用风光光度计测菌液浓度，将叶片分别在不同菌液浓度OD600＝0.3、0.6、0.8、1.0中侵染。结果见表1。当菌液浓度OD600＝0.3时，抗性芽率为5％，随着菌液浓度的增加分化率明显提高。当菌液浓度为0.6时，抗性芽率为15％，达到最佳，而当菌液浓度为OD600＝0.8～1.0时，叶片抗性芽率降低，部分叶片出现褐化或者黄化现象，可能是菌液浓度过高，对叶片产生伤害作用。表1菌液浓度对转化的影响采用上述相同方法对浸染时间进行试验，在OD600＝0.6时进行实验。结果如表2，可知浸染时间在5～10min时，转化效果最好，其中，浸染时间10min转化率最高，此时农杆菌对外植体的伤害较轻，并且也可以确保农杆菌的有效侵染。表2侵染时间对转化的影响采用上述相同方法对共培养时间进行试验，以OD600＝0.6、浸染时间为10min时进行的该组实验。结果如表3所示，可知共培养3d时，抗性芽个数多，抗性芽率较高。因此，河本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种河北杨遗传转化方法，其特征在于：所述河北杨遗传转化方法包括如下步骤：/n(1)以河北杨无菌苗2～6叶片为外植体，沿主脉均匀划伤数道后，远轴面朝上接种于D培养基上暗处预培养1d；其中，所述D培养基为MS+TDZ0.30 mg/L+IBA0.40 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.95～5.98；/n(2)从-80℃冰箱取出保存的农杆菌菌种，用无菌枪头蘸取菌种保存液，在附加50mg/L-kan和25mg/LRif的固体培养基上划板，将平板倒置放入28℃温箱中，暗培养3d至单菌落产生，之后挑取农杆菌单菌落接种于附加抗生素的5mLLB液体培养基中，在恒温摇床上培养24h，之后吸取300μL农杆菌单菌落培养液并将其转接至附加抗生素的50mLLB液体培养基中振荡培养至OD

【技术特征摘要】
1.一种河北杨遗传转化方法，其特征在于：所述河北杨遗传转化方法包括如下步骤：
(1)以河北杨无菌苗2～6叶片为外植体，沿主脉均匀划伤数道后，远轴面朝上接种于D培养基上暗处预培养1d；其中，所述D培养基为MS+TDZ0.30mg/L+IBA0.40mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.95～5.98；
(2)从-80℃冰箱取出保存的农杆菌菌种，用无菌枪头蘸取菌种保存液，在附加50mg/L-kan和25mg/LRif的固体培养基上划板，将平板倒置放入28℃温箱中，暗培养3d至单菌落产生，之后挑取农杆菌单菌落接种于附加抗生素的5mLLB液体培养基中，在恒温摇床上培养24h，之后吸取300μL农杆菌单菌落培养液并将其转接至附加抗生素的50mLLB液体培养基中振荡培养至OD600为0.6，得到侵染菌液；
(3)将经步骤(1)预培养处理后的叶片浸入步骤(2)的侵染菌液中，振荡侵染10min，取出叶片放到无菌滤纸上吸取多余的菌液，接种于D培养基上，在25℃下的暗处共培...

【专利技术属性】
技术研发人员：白玉娥，代金玲，李佳琪，乌日罕，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15