一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用，所述基因为PpTPS3。桃果实的PpTPS3基因表达与芳樟醇含量呈正相关关系。体外功能验证表明，重组蛋白PpTPS3能够以GPP为底物催化合成芳樟醇。在桃果实中过量表达PpTPS3，显著促进了芳樟醇含量的增加。在番茄果实中采用遗传转化技术过量表达PpTPS3也显著提升了芳樟醇的积累。由此表明，所述PpTPS3可显著促进芳樟醇生物合成，是利用基因工程和育种技术改善桃果实芳香品质的重要基因。

【技术实现步骤摘要】
一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用
本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程
，涉及一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用，是一个参与桃果实挥发性萜烯类物质芳樟醇生物合成的基因及应用。
技术介绍
萜类途径挥发性物质是植物种类最为丰富的次生代谢产物，在生长发育过程中具有重要作用。芳樟醇是一种线性的单萜醇，具有花香、甜香和醇香，是很多果实和花香气的重要来源。此外，芳樟醇在植物防御反应及植物间信号转导中发挥重要作用。芳樟醇是重要的化学信息素，可吸引植物取食害虫的天敌或直接作为一些蚜虫的驱虫剂，也具有一定抗菌作用。桃(PrunusPersica)属于蔷薇科、桃属植物，原产于中国，在世界各地均有栽植。桃作为重要的大众经济水果，其基因组较小，可以作为蔷薇科植物研究的模式材料。芳香是影响果实消费的重要品质，芳樟醇是桃果实香味形成的重要物质基础。因此，鉴别参与芳樟醇合成关键基因具有重要生物学和产业意义。芳樟醇是单萜(C10)类化合物，主要在质体中通过甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径合成，其前体物质是牻牛儿基二磷酸(GPP)。萜类合成酶TPS是芳樟醇生物合成途径的末端酶，已经在番茄，苹果，葡萄，猕猴桃，小苍兰等多个物种上有研究。对于芳樟醇等萜类物质而言，它可以由多个TPS催化合成。同时，TPS蛋白可以催化GPP生产多个产物。TPS基因包括多个家族成员，由于萜类物质代谢的复杂性，参与桃果实芳樟醇生物合成的TPS基因有待进一步鉴别。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个参与桃芳樟醇生物合成的基因，所述基因是PpTPS3基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述PpTPS3基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。该基因的特征功能如下：1.基因的表达特征：在不同品种的桃果实，果实的不同发育阶段和不同组织中，PpTPS3的基因表达都与芳樟醇的含量呈正相关关系。在花叶果等组织中，PpTPS3在果实中表达量最高，见实施例1。2.基因的功能特征：在大肠杆菌中表达pET6xHN-N-PpTPS3重组载体从而得到重组蛋白，检测蛋白活性结果证明PpTPS3编码的蛋白能将牦牛儿基二磷酸(GPP)转化为单萜类挥发性物质芳樟醇，见实施例2。本专利技术的另一个目的是提供所述PpTPS3基因在基因工程中的应用，是开展基因工程和改良育种的重要候选基因，可改善果实的芳香品质和提高抗性能力。通过将pGreenII002962-SK-PpTPS3重组载体和pBI121-PpTPS3重组载体分别在桃果实和番茄果实中过量表达，结果证明PpTPS3编码的蛋白能够促进芳樟醇的积累，见实施例3和实施例4。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一个参与桃芳樟醇生物合成的基因PpTPS3,所述PpTPS3基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述PpTPS3的PCR扩增的上游引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述PpTPS3的PCR扩增的下游引物序列如SEQIDNo.3所示。本专利技术提供了上述方案所述基因PpTPS3编码的蛋白质含有535个氨基酸，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种包含上述方案所述基因PpTPS3的重组载体，所述重组载体优选的以pET6xHN-N(Clonetech，Takara)为原始载体，在pET6xHN-N的多克隆位点插入基因PpTPS3。本专利技术还提供了一种包含上述方案所述基因PpTPS3的体外重组蛋白。本专利技术还提供了所述基因PpTPS3的蛋白在体外合成芳樟醇的应用。本专利技术还提供了所述的基因PpTPS3在桃果实和番茄果实中合成芳樟醇的应用。本专利技术还提供了上述方案所述的基因PpTPS3在桃育种中的应用，所述应用优选为基因PpTPS3在桃果实芳香品质改善的基因工程育种中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一个来源于桃的基因PpTPS3，并证明其重组蛋白具有催化合成芳樟醇的活性。本专利技术中，桃果实的PpTPS3基因表达与芳樟醇含量呈正相关关系。体外功能验证表明，重组蛋白PpTPS3能够以GPP为底物催化合成芳樟醇。在桃果实中过量表达PpTPS3，显著促进了芳樟醇含量的增加。在番茄果实中采用遗传转化技术过量表达PpTPS3也显著提升了芳樟醇的积累。所述PpTPS3可显著促进芳樟醇生物合成，是利用基因工程和育种技术改善桃果实芳香品质的重要基因。本专利技术利用基因工程方法过量表达该基因，显著促进了桃果实和番茄果实的芳樟醇含量。本专利技术对于利用基因工程提高芳樟醇含量，提升桃果实芳香品质，具有重要应用价值。附图说明图1：不同桃品种果实的PpTPS3表达与芳樟醇含量。图2：桃果实成熟过程中的PpTPS3表达与芳樟醇含量。图3：重组蛋白PpTPS3催化GPP产生芳樟醇。图4：过表达PpTPS3显著提高了桃果实芳樟醇含量。图5：过量表达PpTPS3显著提高了转基因番茄果实芳樟醇含量。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术做进一步的阐述，但实施例不限制本专利技术保护范围。实施例1桃PpTPS3的表达与芳樟醇含量具有正相关关系(一)实验方法1.桃果实材料采集九个桃品种果实的成熟期样品，包括‘光核桃’(GHT)，‘红根甘肃桃’(HGGST)，‘红花山桃’(HHST)，‘早上海水蜜’(ZSHSM)，‘富阳赤月’(FYCY)，‘红蟠1号’(HP1)，‘红蟠2号’(HP2)，‘湖景蜜露’(HJML)和‘丹霞’(DX)。‘湖景蜜露’桃果实分别在第一次快速生长期(花后34天，34DAB)，硬核期(71DAB)，第二次快速生长期(94DAB)，成熟期(108DAB)和完熟期(111DAB)取样。设置三个生物学重复，每个重复包含5个果实，果肉组织经液氮冷冻后于-80℃保存待用。2.RNA提取和cDNA合成利用CTAB法提取果实组织总RNA，利用PrimeScriptTMRTreagetkitwithgDNAEraser(Takara)试剂盒去除基因组残留DNA并将RNA逆转录合成单链cDNA。3.基因表达测定qPCR以桃PpTEF2(SEQIDNO.5和SEQIDNO.6)为内参基因，PpTPS3引物序列为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。qPCR反应体系总体积为20μL，包括上下游引物(10pM)各lμL，2μLcDNA(或以H2O作为阴性对照)，10μLSsofastEvaGreenSupermix染料(Bio-Rad)和6μLH2O。PCR程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，45个循环；95℃10s；从65℃到95℃，每上升0.5℃读取一次荧光信号值。所用仪器为Bio-RadCFX96(Rio-Rad，Hercules，CA，美国)实时荧光定量PCR仪。不同成熟阶段桃果实的RNA为材料，送由百迈克生物科技有限公司进行开展转录组测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个参与桃芳樟醇生物合成的基因，其特征在于，所述基因为PpTPS3，所述PpTPS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一个参与桃芳樟醇生物合成的基因，其特征在于，所述基因为PpTPS3，所述PpTPS3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述基因，其特征在于，所述基因PpTPS3编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


3.一种包含权利要求1所述基因PpTPS3的重组载体和体外重组蛋白。


4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，魏春艳，柳洪入，陈昆松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33