牛克隆胚胎冷冻液、解冻液、试剂盒、牛克隆胚胎冷冻及解冻方法技术

本发明专利技术提供了牛克隆胚胎冷冻液、解冻液、试剂盒和牛克隆胚胎冷冻及解冻方法，属于体外胚胎冷冻技术，所述冷冻方法如下：将牛克隆胚胎置于基础液中在24～25℃平衡胚胎5～10min后；依次置于第一玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min、第二玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min、第三玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎35～45s，最后置于液氮中冷冻。将冷冻的牛克隆胚胎置于第一解冻液中在37～39℃解冻胚胎50～70s后，置于第二解冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min，最后置于基础液中在24～25℃平衡胚胎4～6min。利用本发明专利技术所述方法，牛克隆胚胎的受胎率高达25％。

【技术实现步骤摘要】
牛克隆胚胎冷冻液、解冻液、试剂盒、牛克隆胚胎冷冻及解冻方法
本专利技术属于体外胚胎冷冻技术，尤其涉及牛克隆胚胎冷冻液、解冻液、试剂盒和牛克隆胚胎冷冻及解冻方法。
技术介绍
人和动物的胚胎的冷冻保存已经是人工生殖领域中一个必要的部分。在过去二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映人工生殖技术的发展程度，现代的冷冻技术已可用在冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎。尤其是玻璃化冷冻技(Vitrification)，不仅已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢速冷冻法，成为冷冻技术的最佳选择。与传统的慢速冷冻法相比，玻璃化冷冻过程使细胞体内不产生水结晶，从而避免对胚胎的伤害。与体内胚胎相比，体外受精胚胎和克隆胚胎的质量较差，抗冻能力弱。胚胎质量的低下导致冷冻解冻后胚胎的复活率和受胎率进一步下降。传统的慢冷冻方法不能有效的冷冻保存这种胚胎，从而大大的限制了体外受精和克隆技术在家畜繁殖育种中的应用。现有的牛胚胎玻璃化冷冻技术的专利技术人，GVajta的方案如下：冷冻液：15％甘油+15％DMSO；38℃；解冻液：1M的蔗糖，38℃；与传统慢速冷冻法相比提高了体内胚胎的冷冻效果和受胎率，但是在克隆胚胎上的应用效果不理想，一般只有5％的受胎率。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种受胎率高的牛克隆胚胎冷冻液、解冻液、试剂盒和牛克隆胚胎冷冻及解冻方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种牛克隆胚胎冷冻液，包括独立存在的基础液、第一玻璃化冷冻液、第二玻璃化冷冻液和第三玻璃化冷冻液；所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数18％～22％的犊牛血清、体积分数0.2％～0.4％的牛血清白蛋白、0.25～0.35mmol/L的丙酮酸钠和3.0～3.5mmol/L的葡萄糖；所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数88％～92％的基础液和体积分数8～12％甘油；所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数68％～72％的基础液、体积分18～22％甘油和体积分数8～12％乙二醇；所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数48％～52％的基础液、体积分24～26％甘油和体积分数24％～26％乙二醇。优选的，所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数19％～21％的犊牛血清、体积分数0.25％～0.35％的牛血清白蛋白、0.28～0.32mmol/L的丙酮酸钠和3.1～3.4mmol/L的葡萄糖。优选的，所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数89％～91％的基础液和体积分数9～11％甘油。优选的，所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数69％～71％的基础液、体积分19～21％甘油和体积分数9～11％乙二醇。优选的，所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数50％的基础液、体积分25％甘油和体积分数25％乙二醇。本专利技术提供了一种利用所述的冷冻液进行牛克隆胚胎冷冻方法，包括以下步骤：将牛克隆胚胎置于所述基础液中在24～25℃平衡胚胎5～10min后；依次置于所述第一玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min、置于所述第二玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min、置于所述第三玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎35～45s，最后置于液氮中冷冻。优选的，所述牛克隆胚胎装于OPS管中后置于液氮中冷冻。本专利技术提供了一种牛克隆胚胎解冻液，包括第一解冻液和第二解冻液；所述第一解冻液包括体积分数为88％～92％所述的基础液和8％～12％半乳糖；所述第二解冻液包括体积分数为93％～97％的所述的基础液和3％～7％半乳糖。本专利技术提供了一种牛克隆胚胎的解冻方法，包括以下步骤：将冷冻的牛克隆胚胎置于第一解冻液中于37～39℃平衡胚胎50～70s后，置于第二解冻液中于24～25℃平衡胚胎4～6min，最后置于基础液中24～25℃平衡胚胎4～6min。本专利技术还提供了一种牛克隆胚胎冷冻试剂盒，包括所述的牛克隆胚胎冷冻液和所述的牛克隆胚胎解冻液。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的牛克隆胚胎冷冻液通过提高防冻剂在冷冻液内的浓度，加速细胞脱水过程；充分的细胞脱水防止冷冻过程中产生冰晶，从而大大降低对胚胎的损伤；能够提高牛克隆胚胎的复苏率和存活率。本专利技术提供的牛克隆胚胎冷冻方法在室温24～25℃平衡胚胎，而不是传统系统里的38℃平衡胚胎，从而降低防冻剂对胚胎的毒性；本专利技术提供的牛克隆胚胎冷冻方法的解冻液采用的半乳糖，对胚胎的毒性大大低于传统的蔗糖；本专利技术提供的牛克隆胚胎冷冻液以及方法，能够产生25％～35％的受胎率。具体实施方式本专利技术提供了一种牛克隆胚胎冷冻液，包括独立存在的基础液、第一玻璃化冷冻液、第二玻璃化冷冻液和第三玻璃化冷冻液；所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数18％～22％的犊牛血清、体积分数0.2％～0.4％的牛血清白蛋白、0.25～0.35mmol/L的丙酮酸钠和3.0～3.5mmol/L的葡萄糖；所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数88％～92％的基础液和体积分数8～12％甘油；所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数68％～72％的基础液、体积分18～22％甘油和体积分数8～12％乙二醇；所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数48％～52％的基础液、体积分24～26％甘油和体积分数24％～26％乙二醇。在本专利技术中，所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，优选的包括体积分数19％～21％的犊牛血清、体积分数0.25％～0.35％的牛血清白蛋白、0.28～0.32mmol/L的丙酮酸钠和3.1～3.4mmol/L的葡萄糖，更优选包括体积分数20％的犊牛血清、体积分数0.3％的牛血清白蛋白、0.3mmol/L的丙酮酸钠和3.3mmol/L的葡萄糖。本专利技术对所述杜氏磷酸缓冲液的来源没有特殊限定，采用市售的杜氏磷酸缓冲液即可。在本专利技术中，所述第一玻璃化冷冻液优选的包括体积分数89％～91％的基础液和体积分数9～11％甘油，更优选的包括体积分数90％的基础液和体积分数10％甘油。在本专利技术中，所述第二玻璃化冷冻液优选的包括体积分数69％～71％的基础液、体积分19～21％甘油和体积分数9～11％乙二醇，更优选的包括体积分数70％的基础液、体积分20％的甘油和体积分数10％的乙二醇。在本专利技术中，所述第三玻璃化冷冻液优选的包括体积分数50％的基础液、体积分25％甘油和体积分数25％乙二醇。在本专利技术的一个优选的具体实施例，所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数20％的犊牛血清、体积分数0.3％的牛血清白蛋白、0.3mmol/L的丙酮酸钠和3.3mmol/L的葡萄糖；所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数90％的基础液和体积分数10％甘油；所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数70％的基础液、体积分20％甘油和体积分数10％乙二醇；所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数50％的基础液、体积分25％甘油和体积分数25％乙二醇。本专利技术提供了一种利用所述的冷冻液进行牛克隆胚胎冷冻方法，包括以下步骤：将牛克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛克隆胚胎冷冻液，其特征在于，包括独立存在的基础液、第一玻璃化冷冻液、第二玻璃化冷冻液和第三玻璃化冷冻液；/n所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数18％～22％的犊牛血清、体积分数0.2％～0.4％的牛血清白蛋白、0.25～0.35mmol/L的丙酮酸钠和3.0～3.5mmol/L的葡萄糖；/n所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数88％～92％的基础液和体积分数8～12％甘油；/n所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数68％～72％的基础液、体积分18～22％甘油和体积分数8～12％乙二醇；/n所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数48％～52％的基础液、体积分24～26％甘油和体积分数24％～26％乙二醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种牛克隆胚胎冷冻液，其特征在于，包括独立存在的基础液、第一玻璃化冷冻液、第二玻璃化冷冻液和第三玻璃化冷冻液；
所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数18％～22％的犊牛血清、体积分数0.2％～0.4％的牛血清白蛋白、0.25～0.35mmol/L的丙酮酸钠和3.0～3.5mmol/L的葡萄糖；
所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数88％～92％的基础液和体积分数8～12％甘油；
所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数68％～72％的基础液、体积分18～22％甘油和体积分数8～12％乙二醇；
所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数48％～52％的基础液、体积分24～26％甘油和体积分数24％～26％乙二醇。


2.根据权利要求1所述的牛克隆胚胎冷冻液，其特征在于，所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数19％～21％的犊牛血清、体积分数0.25％～0.35％的牛血清白蛋白、0.28～0.32mmol/L的丙酮酸钠和3.1～3.4mmol/L的葡萄糖。


3.根据权利要求1所述的牛克隆胚胎冷冻液，其特征在于，所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数89％～91％的基础液和体积分数9～11％甘油。


4.根据权利要求1所述的牛克隆胚胎冷冻液，其特征在于，所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数69％～71％的基础液、体积分19～21％甘油和体积分数9～11％乙二醇。


5.根据权利要求1所述的牛克...

【专利技术属性】
技术研发人员：何牧仁，
申请(专利权)人：草原和牛投资有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15