一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用技术

本发明专利技术提供一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用。所述自杀他杀式质粒包括复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1、scaffold和终止序列。将基因编辑载体转入酿酒酵母中，再转入所述自杀他杀式质粒，即可得到无痕编辑后的酿酒酵母菌株。利用所述自杀他杀式质粒编辑酿酒酵母，既不影响基因编辑后对成功转化基因编辑质粒的菌株进行选择，又显著提高了消除质粒成功率；同时，经过两轮质粒转化即可达到无痕编辑的效果，进一步加快了酿酒酵母无痕编辑的速率。

【技术实现步骤摘要】
一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用
本专利技术涉及基因编辑
的CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用，尤其涉及一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9技术一经问世，便成为世界的焦点之一。CRISPR/Cas9技术主要包含两个要素：切割DNA链的Cas9蛋白和识别靶位点的gRNA。特异性gRNA引导Cas9蛋白对靶位点处DNA双链进行切割造成DNA双链断裂。然后细胞通过本身的修复机制：同源重组系统(HR)和非同源末端连接途径(NHEJ)对断裂的DNA进行修复，实现基因的敲除和插入，达到基因编辑的目的。CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于酿酒酵母基因功能研究、代谢通路研究和菌种改良。对于酿酒酵母基因编辑，一般采用构建基因编辑质粒转化酿酒酵母感受态细胞的方法，转化后质粒永久存在于酿酒酵母菌内。但是，Cas9蛋白持续表达会增大脱靶风险，而且质粒的存在可能影响后续研究。比如，使用含有某种筛选标记的质粒进行基因编辑后，若是研究者想在基因编辑后的菌株中再次转化含有相同筛选标记的质粒继续编辑其它基因或进行其他研究，含有相同筛选标记的质粒再次转化酿酒酵母菌后很难进行下一步筛选。尽管有研究者开发了一些无痕编辑方法，但是仍然存在一些不足。常见的无痕编辑方法包括：1、使用体外转录的gRNA转化酿酒酵母消除其质粒，但是这种方法对体外转录的gRNA质量和转化率要求很高。体外转录的gRNA容易降解，操作困难，耗时耗力耗资。即使成功转化入酿酒酵母，也因其不能长时间存在容易降解而在酿酒酵母中很快失去功能，很难达到消除质粒的效果。2、使用自杀质粒，即将靶位点的DNA片段插入基因编辑质粒中，使得基因编辑质粒中的gRNA在识别靶位点的同时也识别质粒本身，从而引导Cas9切除质粒。但是，使用这种方法时，可能在成功进行基因编辑之前，质粒就被切除，从而无法继续表达Cas9蛋白和gRNA，达不到基因编辑的效果。而且，该方法就算成功进行了无痕基因编辑，因为质粒已被消除失去了筛选标记，很难将成功无痕基因编辑的酿酒酵母菌株筛选出来。因此，提供一种能够实现酿酒酵母的无痕编辑，提高基因编辑与质粒消除的成功率，同时还方便筛选的无痕编辑方法是本领域亟需解决的问题。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用。所述酿酒酵母无痕编辑方法通过转化基因编辑质粒到酿酒酵母菌中进行基因编辑，然后转化自杀他杀式质粒到酿酒酵母中消除基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒，既可以方便成功基因编辑的菌种的筛选，又显著提高了消除质粒成功率，大大提高了酿酒酵母菌无痕编辑的效率。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种自杀他杀式质粒，所述自杀他杀式质粒包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1、scaffold和终止序列。本专利技术中，所述sgRNA1可以引导Cas9蛋白切除基因编辑载体和自身自杀他杀式质粒，将所述自杀他杀式质粒转化到酿酒酵母中，能够同时消除基因编辑质粒和自身，同时实现“自杀”和“他杀”的效果，因而将所述质粒称为“自杀他杀式质粒”。而且，自杀他杀式质粒是一个固定的质粒，不随编辑位点的变化而变化，也不需要每次重新制备，更不容易降解，提高了酿酒酵母菌无痕编辑的效率。作为本专利技术优选的技术方案，所述针对基因编辑载体和自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1为针对Cas9序列设计的sgRNA。优选地，所述sgRNA1表达框中的启动子包括SNR52。优选地，所述Cas9蛋白表达框包含启动子、Cas9蛋白的序列、核定位信号和终止序列。优选地，所述Cas9蛋白表达框中的启动子包括TEF1。优选地，所述Cas9蛋白的核定位信号包括SV40NLS。优选地，所述Cas9蛋白的终止序列包括CYC1。本专利技术中，自杀他杀式质粒为有利于消除基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒的质粒，例如可以是在载体pRCC-K的基础上插入针对基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒共同序列的sgRNA1。所述自杀他杀式质粒除了在sgRNA1表达框的启动子与scaffold间加入了针对酿酒酵母基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒的sgRNA1，其余部分与酿酒酵母基因编辑质粒相同。优选地，所述自杀他杀式质粒与基因编辑载体上的Cas9蛋白表达框相同，所述Cas9蛋白表达框包含启动子、Cas9蛋白的序列、核定位信号和终止序列。作为本专利技术优选的技术方案，所述基因编辑载体包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA2表达框。优选地，所述自杀他杀式质粒的复制起点与基因编辑载体的复制起点相同，所述复制起点包括原核生物中的复制起点和真核生物中的复制起点。优选地，所述自杀他杀式质粒的筛选标记与基因编辑载体的筛选标记相同，所述筛选标记包括原核生物中的筛选标记和真核生物中的筛选标记。优选地，所述原核生物包括大肠杆菌，所述大肠杆菌中的筛选标记包括氨苄。优选地，所述真核生物包括酵母菌，所述酵母菌中的筛选标记包括G418。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的自杀他杀式质粒的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：将sgRNA1序列设计为带有同源臂的正向引物和反向引物，再将所述正向引物和反向引物合成为sgRNA1的双链序列；将载体酶切后的得到的线性化载体与sgRNA1的双链序列混合，反应得到所述自杀他杀式质粒。作为本专利技术优选的技术方案，所述正向引物和反向引物的长度均为50～70bp，例如可以是50bp、52bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、60bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、68bp或70bp，优选为60～65bp。优选地，所述同源臂的长度为30～50bp，例如可以是30bp、32bp、34bp、35bp、36bp、38bp、39bp、40bp、42bp、44bp、45bp、46bp、48bp、49bp或50bp，优选为40～45bp。优选地，所述线性化载体和sgRNA1的浓度总和为100～800ng/μL，例如可以是100ng/μL、200ng/μL、300ng/μL、400ng/μL、500ng/μL、600ng/μL、700ng/μL或800ng/μL等，优选为200～300ng/μL。优选地，所述线性化载体和sgRNA1的摩尔比为1:1。优选地，构建时所用的体系包括：39～41％(例如可以是39％、39.5％、40％、40.5％或41％等)5×pre-assemblybuffer，0.09～0.11％(例如可以是0.09％、0.095％、0.1％、0.105％或0.11％等)T5核酸外切酶，4.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自杀他杀式质粒，其特征在于，所述自杀他杀式质粒包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；/n所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1、scaffold和终止序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种自杀他杀式质粒，其特征在于，所述自杀他杀式质粒包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；
所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1、scaffold和终止序列。


2.根据权利要求1所述的自杀他杀式质粒，其特征在于，所述针对基因编辑载体和自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1为针对Cas9序列设计的sgRNA；
优选地，所述sgRNA1表达框中的启动子包括SNR52；
优选地，所述Cas9蛋白表达框包含启动子、Cas9蛋白的序列、核定位信号和终止序列；
优选地，所述Cas9蛋白表达框中的启动子包括TEF1；
优选地，所述Cas9蛋白的核定位信号包括SV40NLS；
优选地，所述Cas9蛋白的终止序列包括CYC1。


3.根据权利要求1或2所述的自杀他杀式质粒，其特征在于，所述基因编辑载体包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA2表达框；
优选地，所述自杀他杀式质粒的复制起点与基因编辑载体的复制起点相同，所述复制起点包括原核生物中的复制起点和真核生物中的复制起点；
优选地，所述自杀他杀式质粒的筛选标记与基因编辑载体的筛选标记相同，所述筛选标记包括原核生物中的筛选标记和真核生物中的筛选标记；
优选地，所述原核生物包括大肠杆菌；
优选地，所述真核生物包括酵母菌。


4.如权利要求1～3任一项所述的自杀他杀式质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
将sgRNA1序列设计为带有同源臂的正向引物和反向引物，再将所述正向引物和反向引物合成为sgRNA1的双链序列；将载体酶切后的得到的线性化载体与sgRNA1的双链序列混合，反应得到所述自杀他杀式质粒。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述线性化载体和sgRNA1的浓度总和为100～800ng/μL，优选为200～300ng/μL；
优选地，所述线性化载体和sgRNA1的摩尔比为1:1；
优选地，所述反应条件包括在49～51℃下反应0.5～2h，优选为在50℃下反应1.5h。


6.一种酿酒酵母无痕基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建基因编辑载体并将其转入酿酒酵母的感受态细胞中，筛选出成功转入所述基因编辑载体的酿酒酵母；
(2)将如权利要求1～3任一项所述的自杀他杀式质粒转入步骤(1)所得到的酿酒酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱佑民，陶小倩，程倩，王梓旭，邢妍婧，赵一凡，柳伟强，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32