快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组、检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及植物病毒检测技术领域，公开了快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组，包括引物对一和引物对二，所述引物对一用于检测八仙花HdCMV病毒，所述引物对二用于检测八仙花HdRSV病毒；本发明专利技术还公开了利用引物组检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的方法；本发明专利技术还公开了引物组在制备检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的试剂盒中的应用。本发明专利技术设计的引物组使两种病毒的电泳检测条带分离更明显，使检测的灵敏度和准确度更高，使检测结果具有100％的可信度，便于同时检测，提高了八仙花病毒检测的速度。

【技术实现步骤摘要】
快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组、检测方法及应用
本专利技术涉及植物病毒检测
，具体涉及快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组、检测方法及应用。
技术介绍
八仙花(Hydrangeamacrophylla)又名绣球、阴绣球，是虎耳草科(Saxifragaceae)绣球属植物，属暖温带半耐寒性落叶小灌木，原产于中国与日本。因其漂亮的花序和丰富的花色，主要用于庭院、切花和盆栽等观赏用途。目前在德国、法国和荷兰等欧美国家被广泛地栽植和应用，是四大盆栽花卉之一；在中国，主要用于切花和绿化，但是盆栽八仙花已开始引起消费者的喜爱。八仙花的花瓣或花瓣状萼片颜色多样，有白色、粉色、红色、紫红色、紫色、紫罗兰色和蓝色，尤其是蓝色备受消费者青睐。由于八仙花是无性繁殖植物，非常容易感染病毒。据报道，在全球范围内已经发现八仙花感染多种病毒，如：AMV(Alfalfamosaicvirus)、CMV(Cucumbermosaicvirus)、HdMV(Hydrangeamosaicvirus)、HdLV(Hydrangealatentvirus)、HdRSV(Hydrangearingspotvirus)、TRSV(Tobaccoringspotvirus)、ToRSV(Tomatoringspotvirus)、HdCMV(Hydrangeachloroticmottlevirus)、HdLV(Hydrangealatentvirus)、TSWV(Tomatospottedwiltvirus)、EMoV(elmmottlevirus)等。在生产中，专利技术人发现很多引自国外的八仙花品种中均有植株生长不正常、叶片畸形的现象，而每一株出现上述现象的八仙花植株均含有HdCMV和HdRSV两种病毒，说明这两种病毒是危害八仙花植株的主要病毒，对我国的八仙花种植业影响很大。然而我国在进出口贸易中又没有相应的病毒检测体系来监测进口种苗质量，所以专利技术人专利技术了快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组、检测方法及应用。
技术实现思路
基于以上问题，本专利技术提供快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组、检测方法及应用，本专利技术能够快速准确地同时鉴定出HdCMV和HdRSV两种八仙花病毒，且灵敏度高。为解决以上技术问题，本专利技术提供了快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组，包括引物对一和引物对二，所述引物对一用于检测八仙花HdCMV病毒，所述引物对二用于检测八仙花HdRSV病毒，所述引物对一和引物对二的序列如下：为解决以上技术问题，本专利技术还提供了利用引物组检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的方法，将引物对一和引物对二同时加入PCR反应体系中，并以被检测八仙花的基因组DNA为模板进行基因扩增，扩增结束后取5μL扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳；所述PCR反应体系为20μL的体系：模板cDNA1μL，HdCMV-F2Primer0.5μL，HdCMV-R2Primer0.5μL，HdRSV-F2Primer0.5μL，HdRSV-R2Primer0.5μL，2×TaqPCRMagicMix10μL，ddH2O7μL；PCR反应程序为：94℃、3min；然后10个循环：94℃、30sec，68℃、每循环下降0.6℃、30sec，72℃、1min；然后27个循环：94℃、30sec，62℃、30sec，72℃、1min，最后72℃、5min。为解决以上技术问题，本专利技术还提供了引物组在制备检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术设计的引物组除了遵循最基本的原则外，还具有以下优势：(1)HdCMV和HdRSV两种病毒序列扩增产物的大小均为100-500bp，且HdCMV病毒序列的扩增产物的大小与HdRSV病毒序列的扩增产物的大小相差100bp以上，从而使两种病毒的电泳检测条带分离更明显，使检测结果更加准确；(2)HdCMV种病毒序列的两条引物在HdRSV病毒的序列中无结合位点，同样，HdRSV种病毒序列的两条引物也在HdCMV病毒的序列中无结合位点，使检测的灵敏度和准确度更高，使检测结果具有100％的可信度；(3)两对引物的退火温度相近，便于同时检测。同时，本专利技术的检测方法能同时鉴定HdCMV和HdRSV两种八仙花病毒，提高了八仙花病毒检测的速度。附图说明图1为本专利技术的实施例中提取的18个感染了HdCMV和HdRSV病毒的八仙花品种样本的总RNA电泳图；图2为本专利技术的实施例中的HdCMV病毒CP序列扩增电泳图；图3为本专利技术的实施例中的HdRSV病毒CP序列扩增电泳图；图4为本专利技术的实施例中的测序的三个八仙花品种的HdCMVCP病毒序列(4-1、4-2、4-3)与NCBI数据库中已有的HdCMVCP病毒序列比对信息图；图5为本专利技术的实施例中的测序的三个八仙花品种的HdRSVCP病毒序列(5-1、5-2、5-3)与NCBI数据库中已有的HdRSVCP病毒序列比对信息图；图6为本专利技术的实施例利用HdCMVF2/R2引物对和HdRSVF2/R2引物对对18个八仙花样本同时PCR扩增的电泳图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。实施例：在本实施例中，专利技术人对18个感染HdCMV和HdRSV病毒的八仙花品种单株叶片进行了总RNA提取(EASYspinPlusPlantRNAKitRN38，北京艾德莱生物有限公司)，对提取的总RNA样本进行了1.2％琼脂糖凝胶电泳检测和QuawellQ3000检测。检测结果表明提取的总RNA的样本的完整性好，见附图1，可见无蛋白质污染；之后参照RevertAidTM第一链cDNASynthesis试剂盒(ThermoFisherScientific)的说明书将RNA反转录成cDNA。专利技术人在后续实验中开发了如下表格中的HdCMV和HdRSV的coatprotein(CP)基因引物对，引物信息如下：利用已开发的上述HdCMV和HdRSV的coatprotein(CP)基因引物对，对18个cDNA样本进行CP序列PCR扩增，PCR反应体系为20μL的体系：模板cDNA1μL，PCRFPrimer0.5μL，PCRRPrimer0.5μL，2×TaqPCRMagicMix10μL，ddH2O8μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min；反应结束后，取5μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳并观察拍照；结果见附图2和附图3，结果显示：虽获得了预期的目的片段，但是有较弱的非特异条带存在，而且扩增片段较大。为了更加准确、快速的检测八仙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组，其特征在于，包括引物对一和引物对二，所述引物对一用于检测八仙花HdCMV病毒，所述引物对二用于检测八仙花HdRSV病毒，所述引物对一和引物对二的序列如下：/n

【技术特征摘要】
1.快速同时检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的引物组，其特征在于，包括引物对一和引物对二，所述引物对一用于检测八仙花HdCMV病毒，所述引物对二用于检测八仙花HdRSV病毒，所述引物对一和引物对二的序列如下：





2.利用权利要求1所述的引物组检测八仙花HdCMV和HdRSV病毒的方法，其特征在于，将引物对一和引物对二同时加入PCR反应体系中，并以被检测八仙花的基因组DNA为模板进行基因扩增，扩增结束后取5μL扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳；
所述PCR反应体系为20μL的体系：模板cDNA1μL，HdC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春，袁素霞，杨锁宁，张盖天，祁慧，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11