一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品制造技术

本发明专利技术提供一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品，其制备方法为以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入用于TYMS基因及β‑actin基因表达水平检测的特异性引物和PCR反应试剂并进行PCR扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类TYMS基因及β‑actin基因检测标准品为模板获得的标准曲线，获得TYMS基因表达量，并将标准品等体积混合得到检测标准对照品。本发明专利技术利用人工构建基因标准品模拟群体样本的中位值作为对照进行检测，并使用热启动酶保证检测结果的准确性和体系的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品
本专利技术应用于基因检测
，具体涉及一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品。
技术介绍
氟类药物包括5-FU、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等,对消化道肿瘤及其他实体瘤均有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。当氟类药物进入人体后，可被转化为活性代谢产物一磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUMP)、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUTP)和三磷酸氟尿嘧啶(FUTP)等嘧啶类核苷酸类似物，进而产生抗肿瘤活性。TYMS(ThymidylateSynthetase，TS)基因编码的胸苷酸合成酶，是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，也是氟类药物发挥细胞毒作用的目标酶。氟类药物转化为FdUMP后，与TS、5,10-亚甲基四氢叶酸结合形成三联复合物，dUMP与TS结合后转化为脱氧胸腺嘧啶核苷dTMP，使DNA合成受限。多种肿瘤的临床研究均显示TYMSmRNA表达水平与氟类药物疗效密切相关，例如：结直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等。临床研究表明，低TYMSmRNA水平的肿瘤患者接受氟类药物化疗的效果较好，中位生存期较长。反之，TYMS高表达的患者接受氟类治疗疗效较差。目前，在临床肿瘤标志物检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染色)、流式细胞技术、免疫放射法等传统技术，但存在实验过程过于繁琐，结果读取主观影响较大等缺点。近年来，荧光定量PCR凭借检测时间短、检测敏感性高及能进行实时检测，反应基因在组织中的初始含量，检测时间短，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方法。荧光定量PCR常见方法有SYBRGreenI染料法和TaqMan探针法。其中，SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如TaqMan法，且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性。现有文献和报道中常用的检测TYMS基因表达量检测方法，是在采用荧光定量PCR的基础上，人工合成标准品，然后通过相对定量的方法来判定TYMS基因表达量。临床上主要是基于统计样本中中位值来判断待检样本TYMS表达水平的高低，通过人工合成标准品作为对照，只能检测样本中TYMS基因相对人工合成标准品的表达量，并不能真实反映该样本中TYMSmRNA水平相对大数据中中位值的高低。因此单独检测TYMSmRNA表达量对于临床用药指导意义有限，临床还是需要大规模统计样本才可以判定某一样本中TYMSmRNA表达水平的高低。因此采用单独检测TYMSmRNA拷贝数对于临床用药指导意义有限，临床还是需要大规模统计样本才可以判定某一样本中TYMSmRNA表达水平的高低。如果每次检测都要进行大规模统计样本分析用于临床用药指导，整个检测过程复杂，并且成本高。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述问题，提供一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品。本专利技术标准对照品能够用于评价样本中TYMSmRNA水平相对于中位值的高低，简便快捷。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，包括以下步骤：1)以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入用于TYMS基因表达水平检测的特异性引物和PCR反应试剂并进行PCR扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类TYMS基因检测标准品为模板获得的TYMS基因标准曲线，获得TYMS基因表达量(初始拷贝数)N1/μl；2)以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入用于β-actin基因表达水平检测的特异性引物和PCR反应试剂并进行PCR扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类β-actin基因检测标准品为模板获得的β-actin基因标准曲线，获得β-actin基因表达量(初始拷贝数)N2/μl；3)将所述人类TYMS基因检测标准品、人类β-actin基因检测标准品稀释后等体积混合均匀得到标准对照品。进一步的，所述步骤1)中TYMS基因检测标准品的制备方法为：根据NCBI数据库公布的TYMS基因(GeneID:7298)序列进行质粒构建；合成该序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，作为TYMS基因检测标准品。进一步的，所述TYMS基因检测标准品的碱基序列(SEQIDNO:7)为：CCAGGTGACTTTATACACACTTTGGGAGATGCACATATTTACCTGAATCACATCGAGCCACTGAAAATTCAGCTTCAGCGAGAACCCAGACCTTTCCCAAAGCTCAGGATTCTTCGAAAAGTTGAGAAAATTGATGACTTCAAAGCTGAAGACTTTCAGATTGAAGGGTACAATCCGCATCCAACTATTAAAATGGAAATGGCTGTTTAG。进一步的，所述步骤2)中β-actin基因检测标准品的制备方法为：根据NCBI数据库公布的β-actin基因(GeneID:60)序列进行质粒构建；合成该序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，作为β-actin基因检测标准品。进一步的，所述β-actin基因检测标准品的碱基序列(SEQIDNO:8)为：ACCTGTACGCCAACACAGTGCTGTCTGGCGGCACCACCATGTACCCTGGCATTGCCGACAGGATGCAGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACCCAGCACAATGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTGTGGATCGGCGGCTCCATCCTGGCCTCGCTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAG。进一步的，步骤1)、2)中PCR扩增的条件为：第一阶段：95℃2分钟，1个循环；第二阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，5个循环；第三阶段：95℃30秒，60℃30秒(收集信号)，72℃30秒，40个循环；信号收集：第三阶段60℃收集VIC信号，执行实时PCR。进一步的，一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，包括以下步骤：1)以梯度浓度的人类TYMS基因检测标准品为模板，加入用于TYMS基因表达水平检测的特异性引物、探针和PCR反应试剂，组成PCR反应体系Ⅰ；将所述PCR反应体系Ⅰ进行PCR扩增，绘制TYMS基因标准曲线；2)以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入所述PCR反应体系Ⅰ；将所述PCR反应体系Ⅰ进行PCR扩增，扩增结果对照步骤1)中的TYMS基因标准曲线，获得TYMS基因表达量(初始拷贝数)N1/μl；3)以梯度浓度的人类β-actin基因检测标准品为模板，加入用于β-actin基因表达水平检测的特异性引物、探针和PCR反应试剂，组成PCR反应体系Ⅱ；将所述PCR反应体系Ⅱ进行PCR扩增，绘制β-actin基因标准曲线；4)以血液标准品提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入用于TYMS基因表达水平检测的特异性引物和PCR反应试剂并进行PCR扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类TYMS基因检测标准品为模板获得的TYMS基因标准曲线，获得TYMS基因表达量(初始拷贝数)N1/μl；/n2)以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入用于β-actin基因表达水平检测的特异性引物和PCR反应试剂并进行PCR扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类β-actin基因检测标准品为模板获得的β-actin基因标准曲线，获得β-actin基因表达量(初始拷贝数)N2/μl；/n3)将所述人类TYMS基因检测标准品、人类β-actin基因检测标准品稀释后等体积混合均匀得到标准对照品。/n

【技术特征摘要】
1.一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入用于TYMS基因表达水平检测的特异性引物和PCR反应试剂并进行PCR扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类TYMS基因检测标准品为模板获得的TYMS基因标准曲线，获得TYMS基因表达量(初始拷贝数)N1/μl；
2)以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入用于β-actin基因表达水平检测的特异性引物和PCR反应试剂并进行PCR扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类β-actin基因检测标准品为模板获得的β-actin基因标准曲线，获得β-actin基因表达量(初始拷贝数)N2/μl；
3)将所述人类TYMS基因检测标准品、人类β-actin基因检测标准品稀释后等体积混合均匀得到标准对照品。


2.如权利要求1所述一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中TYMS基因检测标准品的制备方法为：根据NCBI数据库公布的TYMS基因(GeneID:7298)序列进行质粒构建；合成该序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，作为TYMS基因检测标准品。


3.如权利要求1所述一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中β-actin基因检测标准品的制备方法为：根据NCBI数据库公布的β-actin基因(GeneID:60)序列进行质粒构建；合成该序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，作为β-actin基因检测标准品。


4.如权利要求1所述一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，其特征在于：步骤1)、2)中PCR扩增的条件为：
第一阶段：95℃2分钟，1个循环；
第二阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，5个循环；
第三阶段：95℃30秒，60℃30秒(收集信号)，72℃30秒，40个循环；
信号收集：第三阶段60℃收集VIC信号，执行实时PCR。


5.如权利要求1-4中任一项所述一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，其特征在于：一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制备方法，包括以下步骤：
1)以梯度浓度的人类TYMS基因检测标准品为模板，加入用于TYMS基因表达水平检测的特异性引物、探针和PCR反应试剂，组成PCR反应体系Ⅰ；将所述PCR反应体系Ⅰ进行PCR扩增，绘制TYMS基因标准曲线；
2)以血液标准品提取的RNA反转录的cDNA为模板，加入所述PCR反应体系Ⅰ；将所...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩勋领，孙松松，罗锋，
申请(专利权)人：重庆浦洛通基因医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50