3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶及其应用。3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID.2。本发明专利技术的KsdD211能够催化雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮(4‑AD)反应生成雄甾‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD，1,4‑雄烯二酮)，TLC分析验证了其高酶学活性。HPLC分析KsdD211催化反应表明，KsdD211在18h内完全转化4‑AD生成ADD。

【技术实现步骤摘要】
3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用
本专利技术涉及生化领域，具体地，涉及3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用。
技术介绍
当甾体类化合物导入双键后，如在抗炎甾体激素药物母核的C1,2位导入双键后，能成倍地增加其抗炎作用，如醋酸可的松C1,2位上导入双键后行成的醋酸脱氢可的松，其抗炎作用提高了3-4倍，并且减少了由钠滞留而带来的副作用；还有许多临床上常用的重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及到微生物C1,2位的脱氢反应，包括氢化泼尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(batemethasone)、氟可龙(fluocortolone)、氟轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(medrol)等。3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD)是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子，可以催化3-甾酮类固醇母核A环1,2位的碳碳单键(C-C)脱氢变成碳碳双键(C＝C)。如下反应过程所示，KsdD催化雄烯二酮(4-AD)的C1,2位脱氢反应生成1,4-雄烯二酮(ADD)。KsdD酶已经在很多降解甾醇的细菌中被发现，如简单节杆菌，紫红红球菌、睾丸酮假单胞菌、珊瑚诺卡氏菌、耻垢分支杆菌。由于不同来源KsdD酶，他们它们的氨基酸序列不同，蛋白酶构象存在差异性，导致底物的专一性也不同。从4-AD转化而来的ADD是合成类固醇药物的重要前体，例如避孕药，雌激素和孕激素。尽管化学方法已用于Δ1-脱氢将不饱和度引入醋酸氢化可的松(HA)的1,2-位时，醋酸泼尼松龙(PA)的抗炎活性提高了三到四倍。然而，由于类固醇结构的复杂性，传统的化学方法难以专门修饰类固醇中间体，化学方法存在转化率低，副产物多，环境污染等缺陷。高效酶法工艺制备类固醇中间体，与激素药物的多步化学合成相比，效率高，产物纯度高。因此，酶促转化由于其温和的反应条件，高效率和特异性(区域选择性和立体选择性)而引起了广泛关注。国内国外对KsdD酶的研究角度不同。国内主要是筛选菌种、基因的异源表达和酶催化反应体系的优化。国外主要集中于对分子机理的探讨，主要表现为酶的分子特性、催化特性、光谱特性分析等。国外学者完成了不同菌属来源的KsdD的分子特性、催化特性和光谱特性的研究。并通过对KsdD氨基酸序列比对，进行了FAD结合域、酶的活性中心等位点的推定。Pseudomonastestosterone的KsdD基因通过质粒pRG1在大肠杆菌中的表达，表达的蛋白仅有3.3％是可溶的，其余的都是以包涵体的形式存在。Arthrobactersimplex的KsdD基因通过大肠杆菌-链霉菌的穿梭质粒，在Streptomyceslividans中表达，在添加和不添加底物4-AD的情况下，酶活力提高了100倍。通过pDEX-3质粒将Rhodococcusrhodochrous的基因KsdD在大肠杆菌中表达，转化细胞表达出可溶性的KsdD，且表达量是出发菌株的30倍。将Rhodococcuserythropolis的基因KsdD通过pSDH305质粒和pET3b质粒实现了该基因在大肠杆菌中的表达，酶活分别为1.38U/mg和6.0U/mg。将Arthrobactersimplex的KsdD基因通过载体pWB980在枯草芽孢杆菌WB600中表达，胞内外酶活分别为110mU/mg和15mU/mg，约为出发菌的30倍，以4-AD为底物，转化40h达到最大转化率为45.5％。将Arthrobactersimplex的KsdD基因克隆到质粒pET22b和pET32a在E.coliBL21中的异源表达，酶活分别为35.29mU/mg和25.67mU/mg。将分枝杆菌NWIB-01的KsdD通过pUC18在E.coliDH5α中表达，酶活达21.34mU/mg。但这些酶活力较低。3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD211)是来自于分枝杆菌属Mycobacteriumsp.HGMS2，目前还未相关克隆、氨基酸序列和酶活力及应用报道。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种3-甾酮-1,2-脱氢酶，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的氨基酸序列为SEQID.2。在上述3-甾酮-1,2-脱氢酶中，其中，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的N端带有His6标签。本专利技术还提供了一种表达上述3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQID.1。本专利技术还提供了一种表达载体，其中，所述表达载体用于表达上述3-甾酮-1,2-脱氢酶。本专利技术还提供了上述3-甾酮-1,2-脱氢酶在制备1,4-雄烯二酮中的应用。本专利技术的KsdD211能够催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)反应生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD，1,4-雄烯二酮)，TLC分析验证了其高酶学活性。HPLC分析KsdD211催化反应表明，KsdD211在18h内完全转化4-AD生成ADD。附图说明图1示出了琼脂糖胶分析PCR扩增KsdD211基因产物，从右到左依次为温度梯度50℃、52℃、54℃、56℃、60℃。图2示出了琼脂糖凝胶图分析pRSV-KsdD211/DH5a菌落PCR，其中1#、3#、5#、7#、8#有目的条带，从中选取3#、7#摇菌测序。图3示出了His-KsdD211蛋白表达条件优化，其中，图3中的(a)、(b)、(c)、(d)为不同表达条件下的SD-PAGE图。图4示出了His-KsdD211AKTA图，其中6#-22#为目的蛋白洗脱峰。图5示出了KsdD211蛋白的纯化。其中，(a)：TEV酶切His-KsdD211蛋白His标签后反挂NI-NTAAKTA图；(b)：TEV酶切His-KsdD211蛋白前后SDS-PAGE分析，泳道TEV切：30℃条件下TEV酶切His-KsdD2113h后样；泳道TEV未切：未加TEV酶的His-KsdD211样；泳道2-5：TEV酶切完反挂NI-NTA纯化得到的蛋白样2#、3#、4#、5#。图6示出了阳离子纯化KsdD211SDS-PAGE图。(a)：反挂NI-NTA收集的蛋白样用阳离子交换柱纯化后AKTA图；(b)：阳离子纯化SDS-PAGE胶图，泳道f-t：阳离子柱上样流穿液；其他泳道对应AKTA纯化图谱中的收集管编号。图7示出了His-KsdD211酶活测定曲线。横坐标为时间(s)，纵坐标为吸光度(Abs)。图8示出了pH对酶活影响。横坐标为pH值，纵坐标为酶活相对量。图9示出了His-KsdD211催化4-AD生成ADD。(a)：0h和12h反应情况；泳道1：标样底物4-AD；泳道2：0h反应情况；泳道3：12h反应情况；泳道4：标样产物ADD；(b)：16h和19h反应情况；泳道1和4：标样底物AD和标样产物ADD；泳道2和3：分别是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3-甾酮-1,2-脱氢酶，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的氨基酸序列为SEQID.2。/n

【技术特征摘要】
1.一种3-甾酮-1,2-脱氢酶，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的氨基酸序列为SEQID.2。


2.根据权利要求1所述的3-甾酮-1,2-脱氢酶，其中，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的N端带有His6标签。


3.一种表达根据权利要求1所述的3...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏正定，成细瑶，宋士奎，王宏伟，黄永棋，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42