高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了来源于谷氨酸棒状杆菌的突变的二氨基庚二酸脱氢酶及编码其的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的表达载体、含有该表达载体的表达系统，以及所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶及编码其的核苷酸序列、所述表达载体和所述表达系统在生产L‑赖氨酸中的应用及生产方法。本发明专利技术含有突变的二氨基庚二酸脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌生产L‑赖氨酸的产率高。

【技术实现步骤摘要】
高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶及其在生产L-赖氨酸中的应用。
技术介绍
赖氨酸(lysine)，化学名称为2,6-二氨基己酸，性状为白色或近白色结晶性粉末，几乎无臭。赖氨酸有L-型、D-型和DL-型3种旋光异构体，然而可供人类和动物吸收利用的只有L-型赖氨酸。L-赖氨酸广泛应用于饲料、食品及医药工业中。目前，90％以上的L-赖氨酸产品可用于饲料添加剂。用于制备L-赖氨酸的方法主要有三种：微生物发酵法、蛋白水解抽提法和化学合成与酶法。微生物发酵L-赖氨酸又可分为前体发酵法和直接发酵法。其中，前体发酵法是以二氨基庚二酸(DAP)为底物，借助微生物或酶转化为L-赖氨酸；直接发酵法是指利用具有合成L-赖氨酸能力的微生物，通过生物合成途径将碳水化合物转化为L-赖氨酸。工业生产中，用来发酵生产L-赖氨酸的细菌主要是棒杆菌属的杆状细菌和埃希氏菌属的大肠杆菌。这些细菌的获得，一方面可以从自然界分离得到，另一方面也可以通过诱变或基因工程改造的方法得到，或者两者兼而有之。现有文献中已有关于对二氨基庚二酸脱氢酶的编码基因ddh改造的相关报道。但主要都是通过对基因ddh进行强启动子的替换，或增加其在菌体中的拷贝数，以此来提高基因ddh在菌体中的表达量，进而提高L-赖氨酸的产量。例如，WO2009096690、WO2009014117、CN106318964B、CN101824392B等。因此，需要对基因ddh编码区核苷酸序列进行位点突变，开发新的谷氨酸棒状杆菌菌株，以期提高生产L-赖氨酸的量。
技术实现思路
为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶及其应用。第一方面，本专利技术提供一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶，相对于野生型，突变的氨基酸位点选自以下中的一个或几个：F47Y(第47位苯丙氨酸变为酪氨酸)、P73L(第73位脯氨酸变为亮氨酸)、L114V(第114位亮氨酸变为缬氨酸)、Y130H(第130位酪氨酸变为组氨酸)、I159L(第159位异亮氨酸变为亮氨酸)。作为一个具体的实施方案，野生型二氨基庚二酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；编码所述野生型二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。作为一个具体的实施方案，突变的二氨基庚二酸脱氢酶为：(1)：由SEQIDNO.10所示的氨基酸序列组成；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(1)衍生的氨基酸序列。第二方面，本专利技术提供一种编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列。作为一个具体的实施方案，编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列为：(1)由SEQIDNO.8所示的核苷酸序列组成；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。第三方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体含有编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列。第四方面，本专利技术提供一种表达系统，所述表达系统含有所述的表达载体。作为一个具体的实施方案，所述表达系统是能够产生L-赖氨酸的表达系统；优选地，所述表达系统为谷氨酸棒状杆菌。第五方面，本专利技术提供所述表达系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在谷氨酸棒状杆菌中，对二氨基庚二酸脱氢酶进行突变，所述突变的氨基酸位点选自以下中的一个或几个：F47Y(第47位苯丙氨酸变为酪氨酸)、P73L(第73位脯氨酸变为亮氨酸)、L114V(第114位亮氨酸变为缬氨酸)、Y130H(第130位酪氨酸变为组氨酸)、I159L(第159位异亮氨酸变为亮氨酸)。第六方面，本专利技术提供所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶、编码其的核苷酸序列、含有所述核苷酸序列的表达载体、含有所述表达载体的表达系统在生产L-赖氨酸中的应用。第七方面，本专利技术提供利用所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶、编码其的核苷酸序列、含有所述核苷酸序列的表达载体、含有所述表达载体的表达系统生产L-赖氨酸的方法。另外，本专利技术还提供所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的筛选方法，包括以下步骤：(1)从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA中，扩增二氨基庚二酸脱氢酶的编码基因ddh；(2)采用易错PCR技术，以二氨基庚二酸脱氢酶的编码基因ddh为模板，扩增获得突变体基因；(3)将步骤(2)所得易错PCR产物及表达质粒pET-42a用EcoRI和PstI双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB(Kan)平板，将平板置37℃恒温培养箱培养，即得构建好的基因ddh突变体库；(4)LB(Kan)平板上长出菌落，挑取其中的单克隆，转接到LB(Kan)液体培养基中，37℃摇床培养，待菌液OD600值达0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，放回37℃摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，测定二氨基庚二酸脱氢酶野生型和突变体酶活，挑选酶活力最强的菌株M1，并测定其基因的核苷酸序列，结果如SEQIDNO.8所示。本专利技术的突变的二氨基庚二酸脱氢酶及编码其的核苷酸序列还可以通过人工合成序列的方法获得。本文通过对基因ddh编码区核苷酸序列进行位点的突变，得到新的谷氨酸棒状杆菌菌株FYLYS-O4-16，并进行后续发酵试验。发现含有该突变位点的菌株FYLYS-O4-16发酵产L-赖氨酸的量比未含有该突变位点的菌株FYLYS-K3-1发酵产L-赖氨酸的量得到了显著提高。而且，该方法与现有改造的高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高效果，从而在实践上可用于谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-赖氨酸。根据本专利技术的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见以下表格：残基保守性替换残基保守性替换AlaSerLeuIle；ValArgLysLysArg；GlnAsnGln；HisMetLeu；IleAspGluPheMet；Leu；TyrGlnAsnSerThr；GlyCysSerThrSer；ValGluAspTrpTyrGlyProTyrTrp；PheHisAsn；GlnValIle；LeuIleLeu；Val此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.突变的二氨基庚二酸脱氢酶，其特征在于，相对于野生型，突变的氨基酸位点选自以下中的一个或几个：F47Y、P73L、L114V、Y130H和I159L。/n

【技术特征摘要】
20200308 CN 202010154581X1.突变的二氨基庚二酸脱氢酶，其特征在于，相对于野生型，突变的氨基酸位点选自以下中的一个或几个：F47Y、P73L、L114V、Y130H和I159L。


2.根据权利要求1所述的突变的二氨基庚二酸脱氢酶，其特征在于，野生型二氨基庚二酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；编码所述野生型二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。


3.根据权利要求1或2所述的突变的二氨基庚二酸脱氢酶，其特征在于，所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶为：(1)：由SEQIDNO.10所示的氨基酸序列组成；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(1)衍生的氨基酸序列。


4.编码权利要求1-3任一项所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列。


5.一种表达载体，其特征在于，所述表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐斌，汪本助，陈晨，穆晓玲，潘声龙，王舒，唐浩，纪传侠，李维理，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34