一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法技术

本发明专利技术提供了筛选非激动剂型PPARγ配体的方法，所述方法包括不分先后的以下步骤：步骤A、确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性；步骤B、确定待测分子可以与PPARγ的已知完全激动剂竞争结合PPARγ；步骤C、确定待测分子不是PPARγ的拮抗剂型配体；步骤A、B、C全部通过后，认定待测分子为非激动剂型PPARγ配体。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及筛选非激动剂型过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)配体的方法。
技术介绍
1.PPARγ及其配体过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)属于核激素受体家族中的配体激活受体，控制细胞内许多代谢过程。研究发现，PPARγ对脂质代谢、脂肪形成、细胞分裂和凋亡等多种生物学过程具有调节作用，其与配体的相互作用与肥胖、心血管病、糖尿病、高血压及肿瘤等疾病的发生、发展有密切的关联。PPARγ的功能域(domain)包括：N-末端活化域(A/Bdomain)，与PPARγ活化抑制相关；DNA结合域(DNAblindingdomain，DBD)；铰链域(hingedomain又称Cdomain)，DNA配体与此域结合可影响PPAR活性；配体结合域(ligandblindingdomain，LBD)，与配体结合后形成异二聚体，与辅活化子的招募活动和配体依赖性转录激活密切相关。PPARγ配体按来源不同分为生理性配体和药理性配体，后者与PPARγ结合的特异性较强。通过对糖尿病治疗的研究中发现，噻唑烷二酮(thiazolidinedione，TZDs)类药物是PPARγ较强的药理性功能配体。该类药物称为PPARγ完全激动剂，其代表药为罗格列酮、吡格列酮等。尽管PPARγ完全激动剂有非常有效的疗效，但是在应用过程中发现其副作用显著。由于PPARγ参与多种调节通路，激活PPARγ可以导致体重增加、钠水潴留、心血管损伤以及骨质疏松。随后，对PPARγ的药物研发主要集中在寻找转录活性较弱的PPARγ部分激动剂(例如：INT131、balaglitazone)或PPAR多激动剂(如PPARα/γ、γ/δ双激动剂和PPARα/γ/δ泛激动剂)。不同PPARγ配体与PPARγ结合诱导发生的分子构型改变不同，从而导致辅活化或辅抑制蛋白的结合形式各异，引发不同的体内效能和副作用。近年来，一种新的化合物SR1664引起研究者的关注。研究发现，该化合物可以特异性结合PPARγ并抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase5，CDK5)介导的PPARγ磷酸化水平，进而如完全激动剂一样激活PPARγ调节糖脂代谢的相关功能，同时基本不激活PPARγ的转录活性，因此不会引起类似PPARγ完全激动剂的副作用。该化合物与其它相类似功能的化合物被称为非激动剂型PPARγ配体，是理论上最有药用价值的PPARγ配体，也是目前相关领域的药物筛选与研发的热点。2.现有的PPARγ结合分子的检测方法及其弊端1)荧光共振能量转移法(竞争法)该技术是目前对PPARγ与小分子结合最主要的检测技术。GST-PPARγ-LBD、铽(Tb)标记的GST抗体、FluormonePan-PPARGreen与待测分子混合后，室温孵育2小时(h)后检测TR-FRET信号，即检测340nm激发波长、520nm发射波长的荧光值，490nm检测铽信号，通过计算待测分子组与对照组(DMSO)的520nm/490nm比值，获得待测分子的荧光强度。当待测分子为PPARγ配体时，它将与FluormonePan-PPARGreen竞争性结合PPARγ，表现为荧光强度降低。该方法操作步骤繁琐、灵敏度不高、重复性差，容易引入大量的检测误差因素。2)放射性标记法放射性标记的待测分子与PPARγ结合后过滤分离未结合的分子，通过同位素信号的变化量计算结合分子数量。改进的方法原理也是计量放射性信号变化，偶联的微珠与待筛选的受体相连，当放射性配体与受体结合会激活闪烁剂从而发光。但是这种方法计量误差较大，步骤繁琐。3)配体诱导复合物法待测物和PPARγ结合后，通过光谱测定大分子构象的变化，可以测定待测物是否与PPARγ结合。这种检测方法所需时间长，步骤繁琐并且不能进行实时监测。4)表面等离子共振(SPR)技术1、以Biacore为代表的SPR技术是近年来发展出的新型检测方法。基本原理为通过共振角的变化反映了金属膜表面溶液物质浓度的变化。将生物大分子偶联在金属膜的表面构建检测芯片，目标化合物分子流经芯片表面，目标化合物分子与大分子结合导致芯片的膜表面的质量增加，从而引起共振角发生变化。通过计量共振角的变化测定分子间结合的数量及时间。由于SPR技术和相关设备灵敏度及精确性的优势，相比于其它PPARγ结合分子检测方法，有一定优势。在当前的研究中，以Biacore为代表的SPR技术最常用的芯片是CM5等检测物直接交联芯片。对于小分子与靶蛋白之间结合的检测，常把靶蛋白之间交联在CM5芯片上(固定相)，再将待测小分子流过芯片(流动相)，检测相互作用产生的响应值(ResponseUnit，RU值)。利用CM5芯片交联的方法虽然能使用最多剂量的靶蛋白作为固定相，但是其缺点(1)交联过程可能会破坏靶蛋白的天然结构或结合位点；(2)交联后的蛋白会随着时间的延长和检测次数的增加而逐渐减少、变构，甚至完全失活，所以该方法往往只能用于已知的、单一的小分子与靶蛋白之间结合的检测，而很难用于未知的、大样品个数的小分子与靶蛋白之间结合的检测，更难用于靶蛋白结合分子的高通量筛选及小分子结合能力的定量比较。有人提出了一种优化的SPR方案，采用Anti-Histag芯片或NTA芯片等非交联芯片，以提高对小分子的筛选能力。然而，这种方法在筛选非激动剂型PPARγ配体方面几乎无能为力，专利技术人根据实验结果进行分析，主要存在以下几个方面的问题：(1)待测小分子分子量小，响应信号弱，干扰大，不确定性高，定量性差；(2)直接交联固定蛋白的方式导致蛋白不稳定，易失活，实际应用性差；(3)用亲和方式非共价固定蛋白，但固定的蛋白量少，信号更弱。鉴于此，本专利技术提供了一种基于SPR技术建立的筛选非激动剂型PPARγ配体的方法。该方法采用非共价固定，用多肽放大信号，并根据PPARγ与多肽生物特性设计3种SPR检测方式，逐步排除其他配体或无关分子，获得非激动剂配体；具有快速、便捷、定量性强等优点，可显著提高筛选的精确度与效率，使得易于筛选获得新的非激动剂型PPARγ配体。
技术实现思路
本专利技术提供了一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法，所述方法包括以下步骤：步骤A：确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性；步骤B：确定待测分子可以与PPARγ的已知完全激动剂竞争结合PPARγ；步骤C：确定待测分子不是PPARγ的拮抗剂型配体；步骤A、B、C没有先后顺序，全部通过后认定待测分子为非激动剂型PPARγ配体。其中，无促进PPARγ下游转录的活性是指没有使PPARγ被激活后促使其下游的受调控基因转录增强的活性。本专利技术的方法中，使用基于改进的表面等离子共振(SPR)技术鉴定PPARγ与其他分子的相互作用，进一步地，表面等离子共振(SPR)技术使用Biacore实现，例如BiacoreT200；其他分子包括待测分子和各种配体。在一些实施例中，在Bia本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n步骤A：确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性；/n步骤B：确定待测分子可以与PPARγ的已知完全激动剂竞争结合PPARγ；/n步骤C：确定待测分子不是PPARγ的拮抗剂型配体；/n步骤A、B、C没有先后顺序，全部通过后认定所述待测分子为非激动剂型PPARγ配体。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤A：确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性；
步骤B：确定待测分子可以与PPARγ的已知完全激动剂竞争结合PPARγ；
步骤C：确定待测分子不是PPARγ的拮抗剂型配体；
步骤A、B、C没有先后顺序，全部通过后认定所述待测分子为非激动剂型PPARγ配体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法基于改进的表面等离子共振(SPR)技术鉴定PPARγ与其他分子的相互作用。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中使用PPARγ-Histag蛋白通过含有anti-Histag的芯片。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A通过确定待测分子不能促进PPARγ与GST-SRC1的结合来确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤B中所述PPARγ配体的已知完全激动剂是罗格...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长振，李晶哲，
申请(专利权)人：中国中医科学院医学实验中心，
类型：发明
国别省市：北京;11