一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法技术

一种维生素D3羟化酶转化生产25‑羟基维生素D3的方法，该方法按如下步骤进行：a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基，培养至OD600＝1‑5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为1.2‑2mM，诱导温度为28℃，发酵培养16‑24h得发酵液；b.破壁：发酵液通过11000‑13000rpm离心5‑7min，收集菌体，并加入发酵液体积4‑6倍的去离子水洗菌体1‑3次，用磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；等步骤从流程上缩短转化周期，在短时间内直接引入羟基生成活性产物，该转化条件温和。

【技术实现步骤摘要】
一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法
本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法。
技术介绍
骨化二醇，又称为25-羟基维生素D3[25(OH)VD3]，是维生素D3的一种生物活性衍生物，维生素D3在人体内没有活性，必须通过生物酶转化成有活性的生物成分才能发挥作用。动物实验表明，骨化二醇对骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病有明显效果，同时还可用于治疗血液透析所致的低血钙症。还可作为保健食品原料及饲料添加剂使用，在保健食品，医药领域及饲料添加剂等方面有着广泛的应用。25-羟基维生素D3[25(OH)VD3]可以利用化学法合成，但多数化学合成所用到的方法均是径开环、断键、环和、还原、耦合、氧化、纯化等多步骤反应，其化学合成法存在反应步骤多、转化率低、且分离纯化过程复杂等缺点，不利于大规模的工业化生产。近年来，随着产酶菌株的筛选及基因工程菌的开发，使微生物转化维生素D3生产骨化二醇成为研究热点，微生物转化法生产骨化二醇具有生产成本低，反应特异性高，反应条件温和，环境友好等优点，是未来生产骨化二醇的研究重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。简化流程、节约时间、短时间内直接引入羟基生成活性产物，游离酶催化效果好。本专利技术的目的是通过下述技术方案予以实现：一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，该方法按如下步骤进行：a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基，培养至OD600＝1-5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为1.2-2mM，诱导温度为28℃，发酵培养16-24h得发酵液；b.破壁：发酵液通过11000-13000rpm离心5-7min，收集菌体，并加入发酵液体积4-6倍的去离子水洗菌体1-3次，用磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理1-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶一次酶液；d.底物配置：采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，过滤底物，放置冷藏箱冷藏4h，将环糊精与底物融合预埋，摇匀培养3d；e.转化：底物配置采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，缓慢加入到c步骤获得的二次酶液中，同时加入0.1％-0.5％的维生素D3羟化酶的辅因子，在400-700rpm震荡条件下进行游离酶转化；f.将步骤e转化后，进行减压浓缩，收集有机溶剂，对浓缩液进行高温或者低温结晶处理，得到25-羟基维生素D3晶体物质。进一步地，所述a步骤产维生素D3羟化酶的基因工程菌为放线菌或是大肠杆菌。进一步地，所述a步骤的发酵培养基主要成分及其含量为:蛋白胨1％，麦芽糖1.5％、酵母提取物0.6％，NaCl0.2％、0.005％NaF，pH至7.0,转化温度30度。进一步地，所述b步骤的磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液为发酵液体积30-45％的0.4mol/L磷酸与硝酸缓冲液(pH5.8)。进一步地，所述b步骤的高压均质机破壁条件为800-1500bar的压力下处理15-40min。进一步地，所述d步骤的有机溶剂包括无水乙醇、吐温、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚中的任意一种或两种的组合，有机溶剂中维生素D3的浓度为25-30％。进一步地，所述b步骤的发酵液破壁前加入丙酮置于离心管中加入适量乙酸乙酯，摇匀然后在13000r/min，离心7-10min。进一步地，步骤c所述的维生素D3在一次酶液为酶液，其中的终浓度控制为0.2-5g/L。进一步地，所述步骤e的维生素D3羟化酶的辅因子为NAD+和NADP+、细胞色素C、铜盐和铁盐、钙离子中的一种。进一步地，所述d步骤的转化温度为30-45℃、转化周期为24-48h。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术首次采用游离酶法生产25-羟基维生素D3，大幅度增加了酶转化效率，转化率达80％以上，从流程上缩短转化周期。(2)本专利技术破壁后，解除了细胞壁和细胞膜的屏障作用，底物能更加高效的结合到维生素D3羟化酶的结合位点上，转化体系中底物浓度提高。(3)本专利技术游离酶转化体系中无需额外加入表面活性剂，因而避免了其对维生素D3羟化酶活力的影响，并且降低了后续提取工序的成本。(4)本专利技术采用微生物对25-羟基维生素D3进行转化，该转化条件温和，为工业制备提供了一条新的工艺路线。(5)本专利技术采用微生物直接在25-羟基维生素D3的25位引入羟基的方法，解决了有机合成难以实现的问题，在短时间内直接引入羟基生成活性产物。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，该方法按如下步骤进行：a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基，培养至OD600＝1-5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为1.2-2mM，诱导温度为28℃，发酵培养16-24h得发酵液；b.破壁：发酵液通过11000-13000rpm离心5-7min，收集菌体，并加入发酵液体积4-6倍的去离子水洗菌体1-3次，用磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理4-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶一次酶液；d.底物配置：采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，过滤底物，放置冷藏箱冷藏4h，将环糊精与底物融合预埋，摇匀培养3d；e.转化：底物配置采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，缓慢加入到c步骤获得的二次酶液中，同时加入0.1％-0.5％的维生素D3羟化酶的辅因子，在400-700rpm震荡条件下进行游离酶转化；f.将步骤e转化后，进行减压浓缩，收集有机溶剂，对浓缩液进行高温或者低温结晶处理，得到25-羟基维生素D3晶体物质。在本实施例中，所述a步骤的产维生素D3羟化酶的基因工程菌为放线菌或是大肠杆菌。在本实施例中，所述a步骤的发酵培养基主要成分及其含量为:蛋白胨1％，麦芽糖1.5％、酵母提取物0.6％，NaCl0.2％、0.005％NaF，pH至7.0,转化温度30度。在本实施例中，所述b步骤的磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液为发酵液体积30-45％的0.4mol/L磷酸与硝酸缓冲液(pH5.8)。在本实施例中，所述b步骤的高压均质机破壁条件为800-1500bar的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：/na.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基，培养至OD600＝1-5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为1.2-2mM，诱导温度为28℃，发酵培养16-24h得发酵液；/nb.破壁：发酵液通过11000-13000rpm离心5-7min，收集菌体，并加入发酵液体积4-6倍的去离子水洗菌体1-3次，用磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；/nc.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理4-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶一次酶液；/nd.底物配置：采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，过滤底物，放置冷藏箱冷藏4h，将环糊精与底物融合预埋，摇匀培养3d；/ne.转化：底物配置采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，缓慢加入到c步骤获得的二次酶液中，同时加入0.1％-0.5％的维生素D3羟化酶的辅因子，在400-700rpm震荡条件下进行游离酶转化；/nf.结晶：将步骤e转化后，进行减压浓缩，收集有机溶剂，对浓缩液进行高温或者低温结晶处理，得到25-羟基维生素D3晶体物质。/n...

【技术特征摘要】
1.一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：
a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基，培养至OD600＝1-5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为1.2-2mM，诱导温度为28℃，发酵培养16-24h得发酵液；
b.破壁：发酵液通过11000-13000rpm离心5-7min，收集菌体，并加入发酵液体积4-6倍的去离子水洗菌体1-3次，用磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；
c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理4-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶一次酶液；
d.底物配置：采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，过滤底物，放置冷藏箱冷藏4h，将环糊精与底物融合预埋，摇匀培养3d；
e.转化：底物配置采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，缓慢加入到c步骤获得的二次酶液中，同时加入0.1％-0.5％的维生素D3羟化酶的辅因子，在400-700rpm震荡条件下进行游离酶转化；
f.结晶：将步骤e转化后，进行减压浓缩，收集有机溶剂，对浓缩液进行高温或者低温结晶处理，得到25-羟基维生素D3晶体物质。


2.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述a步骤的产维生素D3羟化酶的基因工程菌为放线菌或是大肠杆菌。


3.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述a步骤的发酵培养基主要成分及其含量为:蛋白胨1％，麦芽糖1.5％、酵母提取物0.6％，NaCl0.2％、0.005％NaF，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘婷婷，
申请(专利权)人：沈阳美得欣医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21