一种新型真皮基质脱细胞方法技术

本发明专利技术涉及一种新型真皮基质脱细胞方法，全程采用含有结构稳定剂的溶液处理真皮，包括脱细胞前的浸泡、组织脱细胞、脱细胞后的清洗，包括⑴将真皮基质置于含结构稳定剂的PBS缓冲液中，2‑8℃，200‑500Pa低压浸泡20min‑2h；⑵将真皮基质置于含有结构稳定剂的脱细胞溶液中，2‑8℃，80‑200rpm震荡处理4‑6h；⑶将真皮基质置于含有结构稳定剂的脱细胞溶液中，2‑4℃，超声高压处理30‑60min；超声功率20‑40Hz，压强为200‑500MPa。结构稳定剂包括丝素蛋白、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、蔗糖中的两种或三种。本发明专利技术的脱细胞方法制备的真皮基质，外观更为柔软有韧性，且热稳定性、机械性能和生物活性成分保留量均有所提高，增加了材料的亲水性和细胞亲和性，能够诱导细胞长入。

【技术实现步骤摘要】
一种新型真皮基质脱细胞方法
本专利技术属于生物医用材料领域，涉及真皮基质脱细胞技术，尤其是一种新型真皮基质脱细胞方法。
技术介绍
皮肤由表皮层、真皮层和皮下组织构成，真皮层是一层致密结缔组织，组成成分有胶原纤维、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、血管等。胶原纤维主要是由Ⅰ型胶原蛋白构成，种属间差异很小，而外源细胞、组织液、核酸、脂质是引起免疫原性的因素。真皮基质作为外源组织植入人体时，需要去除细胞、核酸等上述因素才能避免出现免疫排斥反应。真皮基质可来自异体皮、猪皮、牛皮、羊皮等。目前常用的脱细胞方法有物理法(如搅拌、震荡、超声、低渗和高渗)、化学法(如酸、碱、表面活性剂)、酶法(如胰蛋白酶、DNase等)、有机溶剂(如乙醇、丙酮等)，这四种方法处理过程中都会造成真皮基质结构不同程度的损伤，降解基质中的活性因子，导致材料机械性能降低、热稳定性差、生物相容性差。因此在动物真皮脱细胞过程中，如何高效去除免疫原性，同时最大化维持真皮基质三维结构稳定性和保留蛋白聚糖、生长因子等生物活性成分，是当前的技术难点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种在脱细胞过程中有效避免真皮基质结构损伤、确保其机械性能高、热稳定性及生物相容性高的新型真皮基质脱细胞方法。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种新型真皮基质脱细胞方法，包括以下步骤：⑴脱细胞前结构稳定剂的浸泡：a含结构稳定剂的PBS缓冲液的配制：将PBS溶液与结构稳定剂室温100-150rpm震荡混匀5-15min；b将真皮基质置于上述步骤a配置的混合液中，2-8℃，低压浸泡20min-2h，低压压力为：200-500Pa，浸泡比例为溶液体积：真皮基质湿重＝1-3:1(w/v)；⑵脱细胞过程：a含有结构稳定剂的脱细胞溶液的配制：将脱细胞溶液与结构稳定剂室温80-200rpm震荡混匀15-30min；b将真皮基质置于上述⑵a配制的脱细胞混合液中，2-8℃，80-200rpm震荡处理4-6h，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝5-10:1(w/v)；c将步骤⑵b处理后的真皮基质置于⑵a配制的脱细胞溶液中，2-4℃，超声高压处理30-60min，超声功率20-40Hz，压强为200-500Mpa，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝1-3:1(w/v)；⑶等渗清洗：将真皮基质置于⑴a配制的含有结构稳定剂的PBS缓冲液中，2-8℃，80-150rpm震荡处理24-48h，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝10-20:1(w/v)。而且，所述的结构稳定剂为丝素蛋白、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、蔗糖中的两种或三种。而且，所述结构稳定剂组分的质量浓度为：丝素蛋白：5％-20％甘露醇：1％-3％甘氨酸：0.5％-3％精氨酸：0.5％-3％蔗糖：1％-3％。而且，所述的脱细胞试剂为酶类或表面活性剂。而且，所述酶类脱细胞试剂为为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、磷脂酶A2、核酸酶、Dispase中的一种或多种。而且，所述表面活性剂为TritonX-100、CHAPS、SDS、DCA中的两种或三种。而且，表面活性剂浓度为0.01％-2％。本专利技术的优点和积极效果是：1、本专利技术中的脱细胞方法，通过结构稳定剂浸泡，使稳定剂紧密地包裹临近的蛋白质分子，得到黏度很高扩散系数很低的聚合体。脱细胞过程中，脱细胞试剂去除基质中的细胞后，优先与基质表面游离的结构稳定剂反应，这样使得基质表面稳定剂浓度比溶液中稳定剂的总体浓度低,表面张力增加，基质中的蛋白分子的化学势升高而提高了结构上的稳定性。2、本专利技术的脱细胞方法结合了物理法(机械振荡和高压渗透)、化学法(表面活性剂)和酶法，交错连续地脱去真皮基质中的细胞成分，并且在脱细胞过程中全程含有结构稳定剂的保护，使得制备的脱细胞真皮基质外观更为柔软有韧性，热稳定性、机械性能和生物活性成分保留量均有所提高，增加了材料的亲水性和细胞亲和性，能够诱导细胞长入。附图说明图1为本专利技术的HE染色结果图，其中1-1为未脱细胞猪真皮基质，1-2为无结构稳定剂处理脱细胞猪真皮基质，1-3为含结构稳定剂处理脱细胞猪真皮基质；图2为不同处理猪真皮基质中DNA残留量；图3为不同处理猪真皮基质中EGF的含量；图4为不同处理猪真皮基质中bFGF的含量。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。实施例1(1)取新鲜的小牛牛皮(购自屠宰场)，使用取皮机去除牛皮的表皮层和皮下组织，制得0.5mm真皮网状层，立即浸泡于0.1％新洁尔灭溶液中，消毒去脂30min，PBS清洗干净。(2)使用纯化水配置含结构稳定剂10％丝素蛋白、2.5％精氨酸和1％蔗糖的PBS缓冲液，室温下120rpm/min震荡混匀10min，0.45μm水系滤膜过滤除菌。将上面制备的牛真皮置于混合液中，4℃低压浸泡30min，压力为300Pa，浸泡比例为溶液体积：真皮基质湿重＝1:1(w/v)。(3)使用纯化水配置含有10％丝素蛋白、2.5％精氨酸、1％蔗糖、0.25％胰酶、0.15％无花果蛋白酶和PBS的脱细胞混合液，室温下120rpm/min震荡混匀15min，0.45μm水系滤膜过滤除菌。将牛真皮置于脱细胞混合液中，4℃震荡处理4h，转速为120rpm/min，处理比例为混合液体积：异种真皮基质湿重＝6:1(w/v)。将牛真皮取出后再次置于脱细胞混合液中，4℃超声高压处理30min，超声功率20Hz，压强为300Mpa，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝1:1(w/v)。(4)将牛真皮置于如(2)制备的PBS混合液中，4℃震荡处理24h，转速为80rpm/min。处理比例为混合液体积：异种真皮基质湿重＝10:1(w/v)。(5)采用0.9％灭菌生理盐水4℃超声清洗10次，5min/次。清洗后的真皮基质采用4℃湿态保存。(6)将牛脱细胞真皮基质剪裁为0.3cm×4cm的长条，用皮革收缩测定仪检测其热皱缩温度，实验结果表明，同无结构稳定剂处理的脱细胞真皮相比，本专利技术脱细胞方法制备的牛真皮热皱缩温度高，即热稳定性好(见表1)。表.1不同处理牛真皮基质的热皱缩温度热皱缩温度(Ts)：将异种ADM剪裁为0.3cm×4cm的长条，用皮革热皱缩温度仪测定，以纯水为介质，从室温开始加热，每分钟加热2℃。实施例2(1)取新鲜猪皮(购自屠宰场)，使用取皮机去除猪皮的表皮层和皮下组织，制得0.7mm真皮网状层，立即浸泡于0.1％新洁尔灭溶液中，消毒去脂30min，PBS清洗干净。(2)使用纯化水配置含结构稳定剂2.5％甘露醇、1％甘氨酸、1％蔗糖的PBS缓冲液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型真皮基质脱细胞方法，其特征在于：包括以下步骤：/n⑴脱细胞前结构稳定剂的浸泡：/na含结构稳定剂的PBS缓冲液的配制：将PBS溶液与结构稳定剂室温100-150rpm震荡混匀5-15min；/nb将真皮基质置于上述步骤a配置的混合液中，2-8℃，低压浸泡20min-2h，低压压力为200-500Pa，浸泡比例为溶液体积：真皮基质湿重＝1-3:1(w/v)；/n⑵脱细胞过程：/na含有结构稳定剂的脱细胞溶液的配制：将脱细胞溶液与结构稳定剂室温80-200rpm震荡混匀15-30min；/nb将真皮基质置于上述⑵a配制的脱细胞混合液中，2-8℃，80-200rpm震荡处理4-6h，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝5-10:1(w/v)；/nc将步骤⑵b处理后的真皮基质置于⑵a配制的脱细胞溶液中，2-4℃，超声高压处理30-60min，超声功率20-40Hz，压强为200-500MPa，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝1-3:1(w/v)；/n⑶等渗清洗：将真皮基质置于⑴a配制的含有结构稳定剂的PBS缓冲液中，2-8℃，80-150rpm震荡处理24-48h，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝10-20:1(w/v)。/n...

【技术特征摘要】
1.一种新型真皮基质脱细胞方法，其特征在于：包括以下步骤：
⑴脱细胞前结构稳定剂的浸泡：
a含结构稳定剂的PBS缓冲液的配制：将PBS溶液与结构稳定剂室温100-150rpm震荡混匀5-15min；
b将真皮基质置于上述步骤a配置的混合液中，2-8℃，低压浸泡20min-2h，低压压力为200-500Pa，浸泡比例为溶液体积：真皮基质湿重＝1-3:1(w/v)；
⑵脱细胞过程：
a含有结构稳定剂的脱细胞溶液的配制：将脱细胞溶液与结构稳定剂室温80-200rpm震荡混匀15-30min；
b将真皮基质置于上述⑵a配制的脱细胞混合液中，2-8℃，80-200rpm震荡处理4-6h，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝5-10:1(w/v)；
c将步骤⑵b处理后的真皮基质置于⑵a配制的脱细胞溶液中，2-4℃，超声高压处理30-60min，超声功率20-40Hz，压强为200-500MPa，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝1-3:1(w/v)；
⑶等渗清洗：将真皮基质置于⑴a配制的含有结构稳定剂的PBS缓冲液中，2-8℃，80-150rpm震荡处理24-48h，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝10-...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋彩云，李志宏，郭雅楠，柏玮，
申请(专利权)人：百澳瑞派天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12