胶原支架的制备方法及胶原支架技术

本发明专利技术提供了一种胶原支架的制备方法及胶原支架。制备方法包括步骤：对原材料组织进行清洗；对清洗后的原材料组织进行冻融循环处理得到第一中间物；对第一中间物进行脱脂处理得到第二中间物；对第二中间物进行脱细胞处理得到第三中间物；对第三中间物进行脱核酸处理得到第四中间物；将第四中间物进行洗涤和干燥处理，得到胶原支架；采用全能核酸酶溶液进行脱核酸处理，全能核酸酶的含量为100U/L至10000U/L。采用本申请提供的制备方法制备的胶原支架，其构成的三维空间可以促进种子细胞的增殖与迁移、提高种子细胞按照其原始表型表达的稳定性，促进细胞基质的分泌从而增加支架的坚固性。

【技术实现步骤摘要】
胶原支架的制备方法及胶原支架
本专利技术涉及组织工程
，具体涉及一种胶原支架的制备方法及胶原支架。
技术介绍
组织工程(tissueengineering)，是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科，其基本原理是，从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞(又称种子细胞)从组织中分离出来在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料(支架)上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。生物材料支架所形成的三维结构为细胞获取营养、生长和代谢提供了良好的环境。现有方法制备的生物材料支架即胶原支架的总表面积较小且结构可靠性差，另外，现有方法仅能够对单一原材料组织处理制备，适用范围小。
技术实现思路
基于上述现状，本专利技术的主要目的在于提供一种胶原支架的制备方法，以解决现有制备方法存在的上述问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一方面提供了一种胶原支架的制备方法，所述制备方法包括步骤：S100、对原材料组织进行清洗；S200、对清洗后的原材料组织进行冻融循环处理得到第一中间物；S300、对所述第一中间物进行脱脂处理得到第二中间物；S400、对所述第二中间物进行脱细胞处理得到第三中间物；S500、对所述第三中间物进行脱核酸处理得到第四中间物；S600、将所述第四中间物进行洗涤和干燥处理，得到所述胶原支架；其中，所述步骤S500中采用全能核酸酶溶液进行所述脱核酸处理，所述全能核酸酶的含量为100U/L至10000U/L，例如为100U/L、500U/L、1000U/L、1500U/L、2000U/L、2500U/L、3000U/L、3500U/L、4000U/L、4500U/L、5000U/L、5500U/L、6000U/L、6500U/L、7000U/L、7500U/L、8000U/L、8500U/L、9000U/L、9500U/L、10000U/L。首先对原材料组织进行冻融循环处理，在冻融循环过程中形成结冰以及通过冻融循环的盐溶液的浓度变化(冻融循环的冷冻过程中随着温度下降会导致未结冰水中的盐的溶解度出现变化，盐浓度逐渐上升，产生细胞膜内外浓度差)使得细胞破裂，从而提高细胞裂解效果，获得更大的总表面积，从而更有利于组织的再生。其次，由于不同的原材料组织的主要不同在于DNA和RNA不同，本申请的制备方法中设置有特定的脱核酸步骤，在该步骤利用全能核酸酶进行脱核酸处理，从而能够降解所有形式的DNA和RNA，通用性强，适用范围广，可以适用于不同的单一原材料组织以及各种不同原材料组织的组合处理。原材料组织可以为猪、牛、羊等哺乳动物的适于作为原材料的组织或器官，例如心脏、肝脏、肾脏、膀胱、膈肌、大网膜、肠系膜等。优选地，在所述步骤S200中，将清洗后的原材料组织加入到含有三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟且PH值为7.8至8.2的缓冲液中进行所述冻融循环，PH值例如为7.8、7.9、8、8.1、8.2；采用上述缓冲液一方面能够提高细胞裂解效果，另一方面苯甲基磺酰氟的添加能够为组织提供一个稳定的环境，避免细胞内释放的蛋白酶对原材料组织的其他蛋白质结构(构成基质材料的结构)造成破坏，从而保证生成的胶原支架的三维空间更加稳固。优选地，所述缓冲液中，所述三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L至20mmol/L，例如可以为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L、16mmol/L、17mmol/L、18mmol/L、19mmol/L、20mmol/L，进一步优选为8mmol/L至12mmol/L，更进一步优选为10mmol/L，所述苯甲基磺酰氟的质量百分比为0.1％至1％，例如质量百分比为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％，进一步优选为0.8％至1％，更进一步优选为1％。优选地，所述缓冲液中还含有乙二胺四乙酸，所述乙二胺四乙酸的摩尔浓度为1mmol/L至10mmol/L，例如为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L，进一步优选为8mmol/L至10mmol/L，更进一步优选为10mmol/L。利用乙二胺四乙酸来调节缓冲液的PH值，使其PH值控制在7.8至8.2范围内，另外，由于乙二胺四乙酸具有抑制作用，采用其进行PH值调节能够避免因引入新的物质而对原材料组织的其他蛋白质结构(构成胶原支架的结构)造成破坏，从而进一步保证生成的胶原支架的三维空间更加稳固。优选地，所述冻融循环中一次冻融循环包括：首先在-80℃至-20℃温度条件下进行1至8小时的冷冻处理，冷冻处理的温度例如可以为-80℃、-75℃、-70℃、-65℃、-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃，冷冻处理的时长例如可以为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时；然后在30℃至40℃温度条件下进行0.5至1小时的融化处理，融化处理的温度例如可以为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，融化处理的时长例如可以为0.5小时、0.6小时、0.7小时、0.8小时、0.9小时、1小时。优选地，冻融循环的次数可以为2-3次，进一步优选为3次。冻融循环虽然是一种现有的处理技术，但对于要求比较苛刻的胶原支架，融化温度过高会导致蛋白质变性，融化温度过低会导致融解不完全，因苯甲基磺酰氟这种蛋白酶抑制剂半衰期太短，如若融化处理时间过长，会导致细胞裂解后的细胞内蛋白酶对细胞外基质酶解，因此，现有的胶原支架的制备过程中并没有采用这一技术，本申请中，通过对温度和时长的限制，使得冻融循环能够很好的使得细胞破裂且不会对细胞外基质造成破坏。优选地，所述步骤S300包括步骤：S310、采用升浓度梯度的方式利用乙醇对所述第一中间物进行洗涤；S320、采用丙酮、己烷对经所述步骤S310洗涤后的组织进行脱脂处理；S330、采用降浓度梯度的方式利用乙醇对所述步骤S320处理后的组织进行洗涤得到所述第二中间物。步骤S310能够使得组织脱水，采用升梯度乙醇洗涤能够避免直接使用高浓度乙醇使得细胞快速失水形成致密层而影响脱水效果，步骤S330能够使得脱脂后的组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶原支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：/nS100、对原材料组织进行清洗；/nS200、对清洗后的原材料组织进行冻融循环处理得到第一中间物；/nS300、对所述第一中间物进行脱脂处理得到第二中间物；/nS400、对所述第二中间物进行脱细胞处理得到第三中间物；/nS500、对所述第三中间物进行脱核酸处理得到第四中间物；/nS600、将所述第四中间物进行洗涤和干燥处理，得到所述胶原支架；/n其中，所述步骤S500中采用全能核酸酶溶液进行所述脱核酸处理，所述全能核酸酶的含量为100U/L至10000U/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种胶原支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：
S100、对原材料组织进行清洗；
S200、对清洗后的原材料组织进行冻融循环处理得到第一中间物；
S300、对所述第一中间物进行脱脂处理得到第二中间物；
S400、对所述第二中间物进行脱细胞处理得到第三中间物；
S500、对所述第三中间物进行脱核酸处理得到第四中间物；
S600、将所述第四中间物进行洗涤和干燥处理，得到所述胶原支架；
其中，所述步骤S500中采用全能核酸酶溶液进行所述脱核酸处理，所述全能核酸酶的含量为100U/L至10000U/L。


2.根据权利要求1所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，在所述步骤S200中，将清洗后的原材料组织加入到含有三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟且PH值为7.8至8.2的缓冲液中进行所述冻融循环。


3.根据权利要求1所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S300包括步骤：
S310、采用升浓度梯度的方式利用乙醇对所述第一中间物进行洗涤；
S320、采用丙酮、己烷对经所述步骤S310洗涤后的组织进行脱脂处理；
S330、采用降浓度梯度的方式利用乙醇对所述步骤S320处理后的组织进行洗涤得到所述第二中间物。


4.根据权利要求3所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S310包括：
S311、利用浓度50％至70％的乙醇对所述第一中间物进行洗涤得到中间物Ⅰ；
S312、利用浓度99％至100％的乙醇对所述中间物Ⅰ进行洗涤得到中间物Ⅱ。


5.根据权利要求4所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S320包括步骤：
S321、采用丙酮萃取所述中间物Ⅱ中的极性脂肪，得到中间物Ⅲ；
S322、采用己烷和丙酮的混合物萃取所述中间物Ⅲ中的非极性脂肪，得到中间物Ⅳ。


6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：万绵水，林创鑫，
申请(专利权)人：广东泓志生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44