用于产生和纯化来自溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的胶原酶的新方法技术

本发明专利技术要求用于产生和纯化通过非致病性需氧细菌溶藻弧菌解毒化学变型(NCIMB编号：11038，异名LMG 3418，后文中称为溶藻弧菌)产生的微生物胶原酶(微生物胶原酶EC 3.4.24.3)的新方法，该方法以稳定、可重现、便宜的发酵方法提供高产生水平的胶原酶。按照本文所述的方法从溶藻弧菌产生的胶原酶还具有优于其他微生物胶原酶的比活，在水溶液中稳定，且可以冷冻而无显著损伤。本发明专利技术的另一目的是包含按照所述的产生和纯化方法获得的胶原酶的药物组合物，其用于表征为胶原累积的障碍的治疗性处理的目的，或用于从减少局部胶原累积受益的瑕疵/缺陷的处理。

【技术实现步骤摘要】
用于产生和纯化来自溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的胶原酶的新方法本申请为2013年4月17日提交的，专利技术名称为“用于产生和纯化来自溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的胶原酶的新方法”的申请号为201380020103.8的分案申请。
胶原酶是具有蛋白水解活性的金属酶，其需要活性部位中的锌离子来执行其分解天然胶原的具体功能。与其他蛋白酶不同，它们可以在生理pH和温度条件下水解胶原。许多由细菌产生的胶原酶为现有技术中已知(弧菌属(Vibrio)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas))；由梭菌属产生的那些胶原酶广泛用于治疗多种来源的皮肤溃疡、褥疮、不同程度的烧伤和肥大性瘢痕的药物组合物中，因为它们分解存在于坏死组织中的胶原。这便于去除细胞碎片，细胞碎片常构成上皮细胞在创伤愈合和再生上皮过程中迁移的障碍(Rao,D.B.等,1975)。最近也将来自弧菌属的胶原酶用于相似目的(EP1901755)；此专利仅描述了包含角叉藻聚糖作为稳定剂的亲脂性组合物(脂质凝胶(lipogel))。但是，通常由该物质发挥的炎性作用为技术人员已知。在任何情况下，不考虑其来源，胶原酶在水性载体中具有极低的稳定性，因此总是配制在完全亲脂的载体中；和Bionect是具有全亲脂基的软膏剂，其中酶绝非均匀分布，且随时间推移而经历显著的活性丧失。亲脂性载体确保酶的稳定性和药物产品的可保存性，而对其治疗活性不利；胶原酶非常缓慢地从亲脂性载体释放，以致其生物利用率极大地受限。胶原酶也可以用于诸如粘连性囊炎(冻结肩)、掌挛缩病(Dupuytren’scontracture)、纤维性海绵体炎(Peyronie’sdisease)、蜂窝织炎和手术后粘连的障碍的全身治疗，尤其是通过注射。在水性载体中的稳定性对这些应用至关重要。用于掌挛缩病的注射治疗的产品目前已上市(在使用时复溶的亲液物质)，该产品以精确的重量比包含通过发酵溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)提取和纯化的两种胶原酶的混合物。如已述，后者是胶原酶最常见的来源之一；但是，它是需要厌氧发酵的致病微生物(Mandl,I.等,1958,ArchBiochemBiophys,74:465-475)。1972年首次鉴定了无色杆菌属(Achromobacter)的一些菌株的溶胶原活性(Thomson,J.A.,Woods,D.R.和Welton,R.L.1972)，随后对解毒无色杆菌(Achromobacteriophagus)菌株(随后重新归类为溶藻弧菌解毒化学变型(Vibrioalginolyticuschemovar.iophagus)，Emod,I.等1983)进行了第一批研究，这些研究证明了具有高比活的胶原酶的存在(Welton和Woods1973)。关于用来通过发酵产生胶原酶的微生物的选择，溶藻弧菌的使用比溶组织梭菌更有利，因为它是非致病性的，且允许在需氧环境中进行发酵，具有相当大的工业优势。微生物菌株的致病性是重要方面，因为成品中的任意杂质(微生物或蛋白质残余物)可引起严重的副作用。操作致病菌株明显需要在纯化阶段特别注意，因此是更复杂、昂贵的工业方法。产生自溶藻弧菌的微生物胶原酶EC3.4.24.3是Zn2+金属酶，其还因许多原因而不同于由溶组织梭菌产生的胶原酶：·它特异性作用于合成肽Pz-Pro-Leu-Gly-Ala-D-Arg(其中PZ＝4-苯基偶氮苄基氧羰基)，该合成肽是选择用于评价溶胶原活性的合成底物。按照本专利技术产生的来自溶藻弧菌的胶原酶是唯一一种能够在Leu-Gly键处分解胶原的胶原酶(Keil,B.,GillesA.-M.,Lecroisey,A.,Hurion,N.和Tong,N.-T.1975；KeilB.MatrixSuppl.1992；1:127-33)；·它具有比获自溶组织梭菌的类似物高得多的蛋白水解活性；·它在天然胶原的切割位点处具有特异性；它在2个位点处切割天然胶原的螺旋链，优选在距N端3/4的Pro-Y-Gly-Pro序列的Y-Gly键处，其中Y是中性氨基酸。相反，来自溶组织梭菌的胶原酶在天然胶原链中存在多个切割位点(Lecroisey,A.Keil,B.1979)。溶藻弧菌解毒化学变型菌株仅产生一种胶原酶，但纯化产物的SDS-PAGE分析证明保持溶胶原活性的几个具有不同分子量的条带的存在。已将这些低分子量种类归因于该酶的自体蛋白水解过程，该过程受特别配制的缓冲液抑制(Keil-Dlouha,V.1976)。1992年，Takeuchi等从溶藻弧菌克隆了编码胶原酶的整个序列。从核苷酸序列推断的氨基酸序列显示成熟胶原酶由739个氨基酸形成，具有81,875Da的分子量。来自溶藻弧菌的胶原酶的核苷酸和氨基酸序列未与其他胶原酶的序列显示任何显著的相似性(Takeuchi,H.,1992)。到目前为止，用于从所讨论的菌株产生酶的方法产生相当低的产率及尤其是对注射用途而言具有不能令人满意的纯度的产物。专利EP0115974描述了用于产生和纯化来自溶藻弧菌胶原酶的方法；终产品是仅在加入牛皮胶原片段(ASF)后稳定的酶混合物(胶原酶、中性蛋白酶和内切核酸酶)。所获得的物质具有非常低的纯度。此外，在通过注射施用所选择的药物组合物时，ASF的存在可以在制备所鉴定的药物形式时或尤其是在它是动物来源的物质时产生问题。此外，如已述，目前已知的药物组合物采用软膏剂的形式，而对于局部应用，尤其是对于全身施用，胶原酶处于极纯的形式且在水性载体中稳定(以改善酶在组合物中的分布)是至关重要的；绝对优选水性载体用于注射治疗。本专利技术通过公开用于产生和纯化来自溶藻弧菌的胶原酶的创新方法来克服这些问题，该方法的特征在于高产率、重现性、稳定性及成品的高纯度。成品还在水溶液中稳定，因此可以甚至在-20℃和-80℃之间的温度下长期保存而不遭受显著损伤。由于高纯度和胶原链上切割的特异性，本文所要求的胶原酶还可以用来解离组织和分离细胞团或单细胞，以用于需要分离的细胞的所有实验和治疗方法。专利技术详述本专利技术要求用于产生和纯化通过非致病性需氧细菌溶藻弧菌解毒化学变型(NCIMB编号：11038，异名LMG3418，后文中称为溶藻弧菌)产生的微生物胶原酶(微生物胶原酶EC3.4.24.3)的新方法；该方法以稳定、可重现、便宜的发酵方法提供高产生水平的胶原酶。按照本文所述的产生和纯化方法从溶藻弧菌产生的胶原酶的序列(SEQIDNO:1)的特征在于，与由来自溶藻弧菌的胶原酶基因编码的814个氨基酸的序列(本文报道为SEQIDNO:2，对应于微生物胶原酶EC3.4.24.3)相比，缺失了氨基酸1-75。通过本专利技术的方法，产生了成熟蛋白质，该成熟蛋白质是活性核心，由739个氨基酸组成，更确切而言，由氨基酸76-814组成：此外，按照本专利技术的方法从溶藻弧菌产生的胶原酶还具有优于其他微生物胶原酶的比活，更纯，在水溶液中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.来自溶藻弧菌解毒化学变型的纯化的具有SEQ ID NO:1序列的胶原酶，特征在于：/n分子量为82Kda；/n比活在1000和1800nkat/mg之间；/n纯度在98.0和100％之间；/n无微生物或蛋白质污染物；/n在5.5和11之间的pH下稳定；/n在4℃和40℃之间的温度下在水溶液中稳定；/n在4℃下在水溶液中稳定30天；/n在-20℃和-80℃之间的温度下在水溶液中稳定24-48个月；/n获得稳定的亲液粉末的亲液性(lyophilisability)。/n

【技术特征摘要】
20120418 IT PD2012A0001181.来自溶藻弧菌解毒化学变型的纯化的具有SEQIDNO:1序列的胶原酶，特征在于：
分子量为82Kda；
比活在1000和1800nkat/mg之间；
纯度在98.0和100％之间；
无微生物或蛋白质污染物；
在5.5和11之间的pH下稳定；
在4℃和40℃之间的温度下在水溶液中稳定；
在4℃下在水溶液中稳定30天；
在-20℃和-80℃之间的温度下在水溶液中稳定24-48个月；
获得稳定的亲液粉末的亲液性(lyophilisability)。


2.权利要求1的纯化的胶原酶，其中所述胶原酶在pH7.1下在包含25mMTRIS-HCl和10mMCaCl2的水溶液中稳定。


3.权利要求1的纯化的胶原酶，其中所述胶原酶在37℃稳定。


4.权利要求1的纯化的胶原酶，其中所述胶原酶处于具有7-20nkat/mg粉末范围内的酶活性的稳定亲液粉末的形式，其包含：
麦芽糖：95-96％，优选95.75％；
盐：1.0-1.5％，优选1.3％；
胶原酶：2.5-3.5％，优选2.95％。


5.权利要求1-4中任一项的纯化的胶原酶，其用于治疗不同程度的烧伤、褥疮、烫伤、多种来源的皮肤溃疡、血管性和糖尿病性溃疡、蜂窝织炎、手术后粘连、肥大性瘢痕...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·瓦卡罗，M·卡普托，C·库帕里，G·盖恩纳里，
申请(专利权)人：菲迪亚制药股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT