复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体及其复性生产舍雷肽酶的方法技术

本发明专利技术提供了复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，编码该多肽包涵体的基因序列如SEQ ID NO：3所示，或者基因序列为SEQ ID NO：3所示的序列经消除、添加、取代一个或多个碱基后能够编码复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的基因序列。制备方法为采用来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶基因，构建重组质粒并将其转化至宿主细胞中进行表达，然后筛选出高效表达转化子，经乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或其他乳糖类似物诱导产生多肽包涵体。本发明专利技术通过基因工程技术将目的基因克隆至载体中构建表达载体，并将表达载体导入宿主细胞中，经过培养和诱导表达，重组菌株能够表达出复性后具有高舍雷肽酶活性的多肽包涵体。

Peptide inclusion bodies with seretidase activity after refolding and the method of producing seretidase by refolding

【技术实现步骤摘要】
复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体及其复性生产舍雷肽酶的方法
本专利技术涉及一种蛋白质聚集体，具体是涉及具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，同时涉及由该多肽包涵体复性生产舍雷肽酶的方法。
技术介绍
舍雷肽酶是一种由叫做SerratiaE15(沙雷氏菌E15)肠细菌合成的蛋白酶。这种细菌可以在蚕的肠道内发现。沙雷氏菌有很多种类，但除E15菌大部分的沙雷氏菌具有致病性。舍雷肽酶具有很强的溶解纤维蛋白块、消除黏性脓痰和净化炎症病灶面等作用，临床广泛用于呼吸道疾病引起的排痰困难。舍雷肽酶具有化痰、减轻炎症反应、消除水肿或肿胀的作用。舍雷肽酶在许多国家(如日本)都被当做替代药物使用，并且有很长的应用历史。最近的研究还提供了更多它在治疗疼痛和炎症方面有效的证据。其中包括气道慢性肺疾病，慢性耳鼻咽喉疾病，腕管综合征，下颌疼痛，骨关节炎和水肿等。但舍雷肽酶的生产主要是采用从天然菌株沙雷氏菌E15菌种的发酵液中提取，该工艺由于沙雷氏菌研究资料有限，天然菌株发酵不稳定，舍雷肽酶对于菌体本身的毒害性，导致该工艺一直未能取得更大的突破，最终使得舍雷肽酶生产成本高昂，产品市场推广和应用有限。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种生产周期短、且复性后具备舍雷肽酶高活性的多肽包涵体。本专利技术的技术方案是提供一种复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，编码该多肽包涵体的基因序列如SEQIDNO：3所示，或者基因序列为SEQIDNO：3所示的序列经消除、添加、取代一个或多个碱基后能够编码复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的基因序列。进一步地，多肽包涵体的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，或者氨基酸序列为SEQIDNO：4所示序列经消除、添加、取代一个或多个氨基酸后能够形成复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的衍生氨基酸序列。进一步地，合成如SEQIDNO：3所示基因序列的正向引物为SPCE28-F，序列如SEQIDNO：1所示，反向引物为SPCE22-R，序列如SEQIDNO：2所示。进一步地，用于转化表达菌株的重组质粒为pET28a-sp。进一步地，上述基因序列的模板基因来源为沙雷氏菌sp基因。本专利技术还提供上述多肽包涵体的制备方法，即采用来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶基因sp，构建重组质粒pET28a-sp，将上述重组质粒转化至宿主细胞即大肠杆菌BL21中进行表达，采用大肠杆菌BL21能高效表达目的序列，然后筛选出高效表达转化子，经乳糖、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)或其他乳糖类似物诱导产生复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体。进一步地，上述筛选高效表达转化子时，挑阳性克隆单菌落接种于LB培养基上摇床培养，至OD600≈0.5-1时，采用乳糖、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)或其他乳糖类似物诱导产生复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体。更进一步地，摇床培养的条件为28℃-40℃，150-250r/min，培养至OD600＝0.5-1时，采用乳糖、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)或其他乳糖类似物诱导表达。进一步地，通过镍柱纯化多肽包涵体。镍柱使用Ni-琼脂糖凝胶6FF(His标签纯化树脂)。进一步地，通过氯化钠使多肽包涵体复性。本专利技术的优点和有益效果：将舍雷肽酶基因sp通过基因工程技术克隆至载体中构建表达载体，通过转化方法将构建好的表达载体导入宿主细胞即大肠杆菌BL21中，经过培养和诱导表达，该重组使宿主细胞能够表达出复性后具有高舍雷肽酶活性的多肽包涵体。菌株培养周期缩短，生产成本降低，产品纯度更高，提取工艺更为简单。本专利技术在生物医药
具有极大的应用前景和商业价值。附图说明图1为重组质粒pET28a-sp示意图图2为复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体SDS-PAGE电泳。图3为镍柱纯化后的多肽包涵体SDS-PAGE电泳。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步说明。目前舍雷肽酶的生产主要是采用发酵工程从菌株发酵液中提取，但舍雷肽酶对于菌体本身具有毒害性，因此从菌株发酵液直接提取舍雷肽酶的发酵工艺一直未能取得更大的突破，使得舍雷肽酶生产成本高昂，产品市场推广和应用有限。包涵体的形成可以有效的解决这个问题。没有活性的包涵体并不会表达出对细胞的毒害，可使细胞正常生长，产出更多的包涵体，再进一步通过复性可以获得高活性的舍雷肽酶。在解决蛋白毒性问题的同时，包涵体还有易分离的优点，这使得后续处理可以获得高纯度的舍雷肽酶，并且操作简单，成本低廉。因此申请人对如何获得舍雷肽酶包涵体、并保证该包涵体复性后能够具有舍雷肽酶活性进行了研究，并最终提出了如下的解决方案。实施例1通过设计同源性引物，进行PCR扩增获得目的基因。其中正向引物为SPCE28-F：GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCAGCGACAACAGGCTATGAT，反向引物为SPCE22-R：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAACGATAAAATCTGTTGCAACAT。以来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶基因基因组(本实施例利用金斯瑞合成序列提取该基因组)作为模板进行PCR扩增。PCR体系和程序如下PCR反应体系：PCR反应程序：通过PCR扩增得到了目的基因，即复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的DNA序列，如SEQIDNO：3所示，根据该SEQIDNO：3按照中心原则进行翻译，可以得到复性后具有舍雷肽酶多肽包涵体的氨基酸序列，如SEQIDNO：4所示。根据引物(SPCE28-F、SPCE22-R)中涉及的限制性核酸内切酶位点对目的基因(sp基因)和pET表达载体进行酶切，酶切产物进行纯化后采用ExnaseII连接酶对酶切后的pET28a载体和酶切后的sp基因进行连接，如图1所示为重组质粒pET28a-sp的示意图。连接产物通过热激转化进大肠杆菌DH5α，挑取单菌落在LB培养基中培养10-24小时，提取重组质粒。提取的重组质粒热激转化进BL21大肠杆菌中。在含有100ug/ml的卡那霉素的LB培养平板上涂布培养12-24小时。实施例2待单菌落长出后，挑取单菌落到10ul的无菌水中，作为菌落PCR验证模板进行菌落PCR验证。将PCR验证正确的菌落接种到LB液体培养基中，培养条件37℃，培养摇床转速150-250rpm/min。待菌体浓度长到OD(600nm测定)0.5-1之间时，加入IPTG进行诱导，IPTG诱导终浓度0.1-1mmol/L，诱导时间48h。筛选出复性后高活性的菌株。PCR体系组分体积终浓度双蒸水3.2μLT7引物(10μM)0.4μL0.4μMSPCE22-R引物(10μM)0.4μL0.4μM2×TaqMix5μL1×菌液1μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，其特征在于，编码多肽包涵体的基因序列如SEQ ID NO：3所示，或者编码多肽包涵体的基因序列为SEQ ID NO：3所示的序列经消除、添加、取代一个或多个碱基后能够编码复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的基因序列。/n

【技术特征摘要】
1.复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，其特征在于，编码多肽包涵体的基因序列如SEQIDNO：3所示，或者编码多肽包涵体的基因序列为SEQIDNO：3所示的序列经消除、添加、取代一个或多个碱基后能够编码复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的基因序列。


2.如权利要求1所述的复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，其特征在于，所述多肽包涵体的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，或者氨基酸序列为SEQIDNO：4所示序列经消除、添加、取代一个或多个氨基酸后能够形成复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的衍生氨基酸序列。


3.如权利要求1所述的复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，其特征在于，合成如SEQIDNO：3所示基因序列的正向引物为SPCE28-F，序列如SEQIDNO：1所示，反向引物为SPCE22-R，序列如SEQIDNO：2所示。


4.如权利要求1所述的复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，其特征在于，所述编码多肽包涵体的基因序列的模板序列来源于沙雷氏菌。


5.包含如权利要求1所述编码多肽包涵体的基因序列的重组载体。


6.权利要求1至4任一项所述的复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的制备方法，其特征在于，采用来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶基因，构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈豪，田健，张东风，诸辉，
申请(专利权)人：宁波希诺亚海洋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33