工程化的革兰氏阴性细胞内溶素制造技术

本发明专利技术主要涉及抗微生物酶的领域。特别的，本发明专利技术涉及多肽，其包含：球状革兰氏阴性细胞内溶素的氨基酸序列；和i)模块化革兰氏阴性细胞内溶素或ii)噬菌体尾部/基板蛋白的细胞壁结合域的氨基酸序列。本发明专利技术还涉及对应的核酸、载体、噬菌体、宿主细胞和组合物。本发明专利技术还涉及将所述多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞和组合物用于通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法或用于对人体或动物体使用的诊断方法的用途。根据本发明专利技术的多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞和组合物还可用作例如食物或饲料、化妆品中的抗微生物剂，或用作消毒剂。

Engineered gram negative Endolysin

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化的革兰氏阴性细胞内溶素专利
本专利技术属于抗微生物酶领域。特别的，本专利技术涉及一种多肽，其包含球状革兰氏阴性细胞内溶素的氨基酸序列和i)模块化革兰氏阴性细胞内溶素或ii)噬菌体尾部/基板蛋白的细胞壁结合域的氨基酸序列。本专利技术还涉及相应的氨基酸、载体、噬菌体、宿主细胞和组合物。本专利技术还涉及所述多肽、氨基酸、载体、噬菌体、宿主细胞和组合物用于通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法或用于对人体或动物体使用的诊断方法中的用途。本专利技术中的多肽、氨基酸、载体、噬菌体、宿主细胞和组合物还可用作抗微生物剂，例如在食物或饲料中、在化妆品中，或作为消毒剂。
技术介绍
细胞内溶素是由噬菌体(例如细菌病毒)编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体增殖的裂解周期中的基因表达末期中被合成，并通过降解细菌肽聚糖来调节从被感染细胞中释放后代病毒体。就酶活性而言，其通常是β(1,4)-糖基化酶(溶菌酶)、转糖基酶、酰胺酶或内肽酶。细胞内溶素的抗菌应用已经由Gasson于1991年提出(GB2243611)。虽然细胞内溶素的杀菌能力已在很长一段时间内为人所知，但由于抗生素的成功与主导地位，这些酶作为抗菌剂的用途被忽略了。只有在多重耐抗生素细菌出现后，用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单的概念才引起人们的兴趣。出现了开发全新种类的抗菌剂这一引人注目的需求，而细胞内溶素被用作‘酶抗生素(enzybiotic)’-酶和抗生素组成的混合词-，从而完美地满足这一需求。2001年，Fischetti和同事首次证明了噬菌体C1细胞内溶素对A组链球菌的治疗潜力(Nelson等人,2001)。自此以后，许多出版物将细胞内溶素确立为一种控制细菌感染、特别是革兰氏阳性细菌引起的感染的有吸引力的补充替代物。此后，不同的细胞内溶素都证明了其作为酶抗生素对抗其它革兰氏阳性病原体的效力，如肺炎链球菌(Loeffler等人,2001)、炭疽杆菌(Schuch等人,2002)、无乳链球菌(Cheng等人,2005)和金黄色葡萄球菌(Rashel等人,2007)。如今，细胞内溶素疗法最大的挑战是革兰氏阴性细菌对外源的细胞内溶素不敏感，这是由于外膜阻挡了细胞内溶素进入肽聚糖。革兰氏阴性细菌具有外膜，其特点为特征性的不对称双层。外双层膜由包含磷脂(主要是磷脂酰乙醇胺)的内单层膜和主要由单一的糖脂即脂多糖(LPS)组成的外单层膜构成。在细菌领域中LPS的结构具有巨大的多样性，而LPS的结构可被修饰以响应于普遍的环境条件。LPS层的稳定性及不同LPS分子间的相互作用主要是由二价离子(Mg2+,Ca2+)与LPS分子的阴离子部分(脂质A中的磷酸盐基团、内核和KDO的羧基基团)之间的静电相互作用实现的。此外，得益于不存在不饱和脂肪酸，脂质A中稠密而有序地组装的疏水部分形成了具有高粘性的刚性结构。这使得外膜(OM)对亲脂性分子的渗透性较差且带来了额外的稳定性。与革兰氏阴性菌相反，革兰氏阳性菌不具有外膜。胞质膜被最多25nm厚的肽聚糖层(而其在革兰氏阴性菌中仅有最多5nm)包围，其形成细胞壁。革兰氏阳性菌的细胞壁的主要作用是维持细胞形状和抵消细菌细胞的内部压力。肽聚糖，或胞壁质，是由糖和氨基酸组成的聚合物。糖的部分由通过β-(1,4)键连接的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基的交替残基组成，其构成糖部分。由3至5个氨基酸构成的肽链连接在N-乙酰胞壁酸上。肽链可与其它链上的肽链交联形成3D网格状层。肽链可包含L-氨基酸残基和D-氨基酸残基，其组成在不同的细菌中可有所不同。对比由感染革兰氏阳性菌种的噬菌体产生的细胞内溶素和由感染革兰氏阴性细菌种的噬菌体产生的细胞内溶素时，可以看出巨大的差异，即细胞内溶素自身的一般结构的差异。感染革兰氏阳性菌的噬菌体的噬菌体细胞内溶素是模块化的且包含不同的独立的功能区域或模块。最常见的构造为N末端催化域和C末端细胞壁结合域(Loessner,2005)。一些革兰氏阳性细胞内溶素由三个模块组成：具有不同特异性的N-末端和中心催化域及C-末端底物结合模块(Narvarre等人,1999；Pritchard等人,2004；Yokoi等人,2005)。相反地，由与革兰氏阴性宿主细胞关联的噬菌体编码的细胞内溶素通常是非模块化的单一模块的球状蛋白质，只有少数例外。更多关于细胞内溶素作为抗微生物剂的信息见Nelson等人。(“EndolysinsasAntimicrobials”,AdvancesinVirusResearch,Volume83(2012),p.299-365,Eds.M.和W.Szybalski,Elsevier)。同时，已出现了新方案，其还利用由感染革兰氏阴性菌种的噬菌体产生的细胞内溶素来控制由革兰氏阴性细菌造成的感染。为了达到这个目的，将革兰氏阴性菌的细胞内溶素与例如阳离子的、两亲性的、疏水性的或抗微生物的肽融合。这类融合蛋白质可以克服前述由革兰氏阴性菌外膜造成的问题。然而，尽管有关抗菌剂的技术在进步，对于这些抗菌剂设计的进一步改进仍有需求，特别是由于对常见抗生素耐药性的增加。这个问题已由下述和附加的权利要求中的主题解决。专利技术概述本专利技术的专利技术人惊讶地发现将球状革兰氏阴性细胞内溶素与革兰氏阴性细胞内溶素或噬菌体尾部/基板蛋白的细胞壁结合域融合可以产生更有效的革兰氏阴性溶胞壁酶。因此，在第一方面，本专利技术涉及一种多肽，其包含革兰氏阴性细胞内溶素的氨基酸序列和i)革兰氏阴性模块化细胞内溶素或ii)噬菌体尾部/基板蛋白的细胞壁结合域的氨基酸序列。通常取决于所选的成分，本专利技术的该多肽可降解细菌的细胞壁，所述细菌选自不动杆菌(Acinetobacter)、气单胞菌(Aeromonas)、凝聚杆菌(Aggregatibacter)、固氮螺菌(Azospirillam)、拟杆菌(Bacteroides)、伯克氏菌(Burkholderia)、弯曲杆菌(Campylobacter)、厌氧氨氧化菌(Candidatus)、柄杆菌(Caulobacter)、棒状杆菌(Clavibacter)、克洛诺杆菌(Cronobacter)、代尔夫特菌(Delftia)、肠杆菌(Enterobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、埃希氏菌(Escherichia)、黄杆菌(Flavobacterium)、嗜血杆菌(Haemophilus)、碘细菌(Iodobacteria)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、克吕沃尔菌(Kluyvera)、曼海姆氏菌(Mannheimia)、摩根氏菌(Morganella)、奈瑟球菌(Neisseria)、成团泛菌(Pantoea)、巴斯德菌(Pasteurella)、浮游蓝丝藻(Planktothrix)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、雷尔氏菌(Ralstonia)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、大豆根瘤菌(Sinorhizobium)、伴突(Sodalis)、聚球藻(Synechococcus)、Thalassomonas、栖热本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多肽，其包含以下氨基酸序列：球状革兰氏阴性细胞内溶素的氨基酸序列；和i)模块化革兰氏阴性细胞内溶素或ii)噬菌体尾部/基板蛋白的细胞壁结合域的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170403 IB PCT/IB2017/0518861.多肽，其包含以下氨基酸序列：球状革兰氏阴性细胞内溶素的氨基酸序列；和i)模块化革兰氏阴性细胞内溶素或ii)噬菌体尾部/基板蛋白的细胞壁结合域的氨基酸序列。


2.根据权利要求1的多肽，其中所述革兰氏阴性模块化细胞内溶素选自KZ144、EL188、OBPgpLYS、PVPSE1gp146和细胞内溶素。


3.根据权利要求1的多肽，其中所述噬菌体尾部/基板蛋白是选自弧菌噬菌体ICP1和弧菌噬菌体RYC的噬菌体的噬菌体尾部/基板蛋白。


4.根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，其选自由SEQIDNo.:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14组成的序列及与这些SEQIDNo.中的任一个具有至少80％序列同一性的序列的序列组。


5.根据上述权利要求中任一项的多肽，其中所述球状细胞内溶素是内肽酶、壳多糖酶、类T4溶菌酶、类λ溶菌酶、N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶、胞壁酰基-L-丙氨酸-酰胺酶、溶菌酶、裂解性转糖基酶(C)、裂解性转糖基酶(M)、N-乙酰基-溶菌酶、N-乙酰基-氨基葡糖苷酶或转糖基酶。


6.根据上述任意一项权利要求的多肽，其中所述球状细胞内溶素是源自感染了选自以下细菌属的细菌的噬菌体的细胞内溶素，所述细菌属选自不动杆菌、气单胞菌、凝聚杆菌、固氮螺菌、拟杆菌、伯克氏菌、弯曲杆菌、厌氧氨氧化菌、柄杆菌、棒状杆菌、克洛诺杆菌、代尔夫特菌、肠杆菌、欧文氏菌、埃希氏菌、黄杆菌、嗜血杆菌、碘细菌、克雷伯氏菌、克吕沃尔菌、曼海姆氏菌、摩根氏菌、奈瑟球菌、成团泛菌、巴斯德菌、浮游蓝丝藻、假交替单胞菌、假单胞菌、雷尔氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、大豆根瘤菌、伴突、聚球藻、Thalassomonas、栖热菌、弧菌、黄单胞菌、木质部难养菌和耶尔森氏菌。


7.根据上述权利要求中任一项的多肽，其中所述球状细胞内溶素源自表1中所列细胞内溶素。


8.根据权利要求7的多肽，其中所述球状细胞内溶素选自Lys68、ABgp46和Lys394细胞内溶素，特别地，其中球状细胞内溶素是Lys68细胞内溶素。


9.根据上述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含选自由SEQIDNo.:18,19,20,21,22,23,24,25,27和28组成的序列组的氨基酸序列。


10.根据上述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽不包含革兰氏阴性模块化细胞内溶素的氨基酸序列。


11.根据上述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽不包含革兰氏阴性模块化细胞内溶素的酶活性域(EAD)。


12.根据上述权利要求中任一项的多肽，其中所述球状细胞内溶素的酶活性是多肽中唯一的酶活性。


13.根据上述权利要求中任一项的多肽，其中所述球状细胞内溶素的氨基酸序列与任何模块化细胞内溶素的酶活性域氨基酸序列具有小于90％的序列同一性。


14.根据上述权利要求中任一项的多肽，其中所述球状细胞内溶素的氨基酸序列和细胞壁结合域的氨基酸序列为彼此直...

【专利技术属性】
技术研发人员：M格里塞尔，M比布尔，
申请(专利权)人：萨西那帕斯有限公司，
类型：发明
国别省市：泰国;TH