产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种酰胺酶类溶菌酶、所述酰胺酶类溶菌酶的表达载体以及表达系统，尤其涉及产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用。采用本发明专利技术提供的蓝藻工程菌表达并纯化得到酰胺酶类溶菌酶，具有较高的抑菌活性以及酶解肽聚糖的活性，具有重要的医用抗菌、食品防腐、科研工具酶等价值。

【技术实现步骤摘要】
产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用
本专利技术涉及基因工程和酶工程
，具体涉及一种产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用。
技术介绍
溶菌酶(Lysozyme)是一类专门水解细菌细胞壁上黏多糖糖苷键的碱性酶。溶菌酶广泛存在于卵清、唾液、生物液体中，动物组织、植物组织、微生物中也有溶菌酶的存在。医用溶菌酶具有抗菌和抗病毒功效，适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。又由于溶菌酶的无毒、无副作用，其还可以作为天然的食品防腐剂，现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增值。此外，溶菌酶处理细菌还可以协助得到原生质体，因此溶菌酶还是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。蛋清溶菌酶有限的抑菌谱限制了其进一步应用，高提取率和更广泛抑菌谱的微生物溶菌酶正日益受到研究人员重视。但该酶主要溶解革兰氏阳性菌，因而限制了它的进一步应用，且国内蛋清溶菌酶年产量不足50顿，特别是高活性的溶菌酶供应还不能满足日益增长的需求。微生物溶菌酶的研究和应用虽然尚处于起步阶段，但因其较高的提取率、广泛的溶菌谱和优越的抑菌性，正日益受到研究人员的重视。微生物产溶菌酶主要有3种:N－乙酰己糖胺酶、酰胺酶、内肽酶。酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase)是一类作用于肽聚糖酰胺键的溶菌酶，它可以切断细菌肽聚糖中NAM上乳酸的羧基与肽尾丙氨酸之间的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺键。酰胺酶广泛存在于细菌中，但是只有在少数菌株中才检测出活性高的溶菌酶。噬菌体T7溶菌酶就是一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，体外重组表达T7溶菌酶对细菌的肽聚糖有着明显的降解活性，但Zn2+是其酰胺酶活性所必需的。除此之外，鲜有其它种类的具有高效溶菌活性的酰胺酶被报道发现。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶，是目前除噬菌体T7溶菌酶外少数同样属于酰胺酶类溶菌酶的一种，具有重要的医用抗菌、食品防腐、科研工具酶的价值。具体而言，本专利技术提供的酰胺酶类溶菌酶，具有SEQ1所示的氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。本专利技术提供的酰胺酶类溶菌酶具有高效裂解革兰氏阴性菌(大肠杆菌等)的细胞壁功能，具有高效抑菌活性。本专利技术的第二目的是提供编码所述酰胺酶类溶菌酶的基因序列。作为本专利技术的一种优选方案，本专利技术提供的编码酰胺酶类溶菌酶的基因序列，具有SEQ2所示的序列。作为本专利技术的一种优选方案，所述基因序列的N端带有His标签，优选为6～10个His标签，以便于表达后纯化。本专利技术的第三目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶的表达载体，其包含本专利技术所述的基因序列。作为本专利技术的一种优选方案，所述表达载体为蓝藻表达载体。作为本专利技术的一种优选方案，所述表达载体为蓝藻穿梭载体pAQE19。所述蓝藻穿梭载体pAQE19的相关信息，可参见文献DongyiXu2005；PlantPhysiology,July2005,Vol.138,pp.1586–1595。采用该表达载体，可以实现本专利技术所述酰胺酶类溶菌酶的高效表达。作为本专利技术的一种优选方案，所述表达载体包含PcpcBA启动子。所述PcpcBA启动子在野生型蓝细菌中是控制表达藻胆体外周杆藻蓝蛋白α/β亚基的启动子。本专利技术采用所述PcpcBA启动子可以进一步促进本专利技术所述酰胺酶类溶菌酶的高效表达。该启动子具有如SEQ3所示的核苷酸序列。本专利技术的第四目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶的表达系统，其中含有本专利技术所述的表达载体。作为本专利技术的一种优选方案，所述表达系统为蓝藻。作为本专利技术的一种优选方案，所述表达系统为聚球藻。作为本专利技术的一种优选方案，所述表达系统为蓝细菌Synechococcussp.PCC7002。Synechococcussp.PCC7002作为一种能够光合自养的微生物，培养成本低廉，生长速率快，分子和遗传操作十分方便；我们利用其表达酰胺酶类溶菌酶，达到了利用更低成本获取大量具有更高生物学活性的溶菌酶的成果。本专利技术的第五目的是提供一种产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌，其是将包含本专利技术所述基因序列的蓝藻表达载体转化入蓝藻所得。所述蓝藻优选为野生型蓝藻。作为本专利技术的一种优选方案，所述蓝藻表达载体为蓝藻穿梭载体pAQE19。作为本专利技术的一种优选方案，所述蓝藻为聚球藻。作为本专利技术的一种优选方案，所述表达系统为蓝细菌Synechococcussp.PCC7002。采用该藻种构建蓝藻工程菌，可以实现本专利技术所述酰胺酶类溶菌酶的高效表达。作为本专利技术的一种优选方案，所述蓝藻工程菌是将含有所述基因序列的蓝藻穿梭载体pAQE19转入蓝细菌Synechococcussp.PCC7002中所得。经PCR验证，可确认获得转基因产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌。本专利技术提供的蓝藻工程菌利用蓝细菌表达系统能够获得大量的具有生物学活性的酰胺酶类溶菌酶，所述酰胺酶类溶菌酶能降解细菌细胞壁的肽聚糖层并具有高效抑菌活性。本专利技术的第六目的是提供本专利技术所述表达载体、所述表达系统或所述蓝藻工程菌在制备酰胺酶类溶菌酶中的应用。本专利技术的第七目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶的制备方法，该方法包括：将所述的表达系统或所述蓝藻工程菌进行培养，离心富集后，破碎，纯化。作为本专利技术的一种优选方案，所述纯化采用镍柱亲和层析法。本专利技术采用上述方法表达并纯化得到的酰胺酶类溶菌酶，可以使细菌肽聚糖悬浊液变得澄清，通过高效液相色谱分析反应液，发现其能与细菌肽聚糖反应产生小肽分子，具有酶解肽聚糖的活性。说明书附图图1.A为蓝藻工程菌表达载体的示意图，B为验证阳性产溶菌酶工程菌的PCR鉴定图。图2.利用镍柱亲和层析法纯化重组酰胺酶类溶菌酶后的SDS-PAGE蛋白电泳图图3.采用抑菌圈法，验证酰胺酶类溶菌酶对大肠杆菌的抑制活性的结果示意图；A为滤纸片为空白对照，B为经过高温失活的酰胺酶类溶菌酶，C为蛋清溶菌酶，D为酰胺酶类溶菌酶。图4.酰胺酶类溶菌酶高效裂解细菌细胞壁的结果示意图；A为酰胺酶类溶菌酶与细菌细胞壁提取成分(肽聚糖)悬浊液反应24小时后，反应液会变澄清；B为反应液的OD变化曲线图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。蓝细菌Synechococcussp.PCC7002，即野生型聚球藻Synechococcussp.PCC7002，最早在1962年由C.VanBaalen在海洋污垢中分离得到，其来源于法国巴黎的巴斯德研究所蓝藻保藏库(PasteurCultureCollection)。其名称中，“PCC”是PasteurCu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酰胺酶类溶菌酶，其特征在于，具有SEQ1所示的氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种酰胺酶类溶菌酶，其特征在于，具有SEQ1所示的氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。


2.编码权利要求1所述酰胺酶类溶菌酶的基因序列。


3.根据权利要求2所述的基因序列，其特征在于，具有SEQ2所示的基因序列。


4.酰胺酶类溶菌酶的表达载体，其特征在于，包含权利要求2或3所述基因序列；
所述表达载体优选为蓝藻表达载体，更优选为蓝藻穿梭载体pAQE19。


5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中还包含PcpcBA启动子。


6.酰胺酶类溶菌酶的表达系统，其特征在于，含有权利要求4或5所述的表达载体。


7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑正高，董春霞，赵进东，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11