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一种比活提高的溶菌酶突变体制造技术

技术编号:24325338 阅读:61 留言:0更新日期:2020-05-29 17:55
本发明专利技术公开了一种比活提高的溶菌酶突变体,属于生物工程技术领域。本发明专利技术公开了一种利用基因工程在人源溶菌酶C末端添加疏水短肽Val‑Ile‑Pro‑Leu‑Phe而得到的人源溶菌酶突变体,其比活提高了126%。本发明专利技术还公开了一种含突变人源溶菌酶基因的重组质粒,以及经过该重组质粒转化毕赤酵母后获得的高效表达人源溶菌酶突变体的重组毕赤酵母基因工程菌。本发明专利技术获得的人源溶菌酶突变体具有比活高,制备简单的特点,具有潜在的临床应用价值,在饲料、食品工业上也具有广泛的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种比活提高的溶菌酶突变体
本专利技术涉及一种比活提高的溶菌酶突变体,属于生物工程

技术介绍
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,能够水解细菌细胞壁中β-1,4糖苷键,破坏细胞壁肽聚糖的结构,从而保护宿主细胞免受细菌感染。人源溶菌酶属于c型溶菌酶,由130个氨基酸组成,相对分子量为14700。人源溶菌酶还具有抗病毒、增强免疫力和抗肿瘤的功效。溶菌酶作为一种天然蛋白质,能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收,对人及动物无毒害作用,也不会在体内残留,是一种安全性很高的药品、饲料和食品添加剂。在畜牧业溶菌酶可用作饲料防腐剂和杀菌剂。在食品行业,溶菌酶可作为抗菌防腐剂添加到食品中,且对人体无任何毒副作用,也可利用其具有一定甜味的特点,作为低卡路里的食品甜味剂。目前,市场上销售的溶菌酶主要是从鸡蛋清、动物脏器等中提取获得的,这种溶菌酶热稳定性差,活力只有人源溶菌酶活力的一半。但人源溶菌酶受限于原料来源、纯化精制成本等因素,制备量较少,无法满足各领域的需求。因此,提供一种低成本的高产溶菌酶的方法,具有广阔的应用前景。
技术实现思路
为了解决上述问题,本专利技术通过基因工程技术在人源溶菌酶的C末端添加疏水短肽Val-Leu-Phe、Val-Ile-Pro-Leu-Phe或Val-Ile-Pro-Leu-Phe,显著提高人源溶菌酶的比活,有效提升人源溶菌酶的杀菌效果。本专利技术的第一个目的是提供一种比活提高的人源溶菌酶,所述人源溶菌酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示。本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述人源溶菌酶的基因,所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示。本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述基因的载体。在本专利技术的一种实施方式中,所述载体是pPIC9K。本专利技术的第四个目的是提供一种表达上述人源溶菌酶的基因工程菌。本专利技术的第五个目的是提供一种提高人源溶菌酶比活的方法,是在氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的人源溶菌酶的C末端添加疏水短肽Val-Leu-Phe、Val-Ile-Pro-Leu-Phe或Val-Ile-Pro-Ala-Ala-Ile-Pro。在本专利技术的一种实施方式中,所述基因工程菌以毕赤酵母细胞为宿主。在本专利技术的一种实施方式中,所述基因工程菌以毕赤酵母KM71或者GS115为宿主。本专利技术还提供了上述人源溶菌酶在制备饲料添加剂、食品防腐方面的应用。本专利技术还提供了上述人源溶菌酶在食品或饲料领域的应用。与现有的技术相比,本专利技术的优点和积极效果是:本专利技术利用毕赤酵母表达系统来作为生产人源溶菌酶的表达系统,具有生产成本低、操作简单、生长迅速、表达效率高、发酵与分泌性能良好等优点,本专利技术优化后的编码人源溶菌酶m5HLM(氨基酸序列如SEQIDNO:6所示,编码其的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示)的基因经毕赤酵母表达系统产生的人源溶菌酶比活为21043U/g,较野生型提高了约126%。本专利技术通过基因工程技术在人源溶菌酶的C末端添加疏水短肽Val-Leu-Phe、Val-Ile-Pro-Leu-Phe或Val-Ile-Pro-Leu-Phe,分别获得人源溶菌酶m3HLM、m5HLM、m7HLM,其比活相对于野生型分别提高了40.32%、126.15%、79.80%,有效提升了人源溶菌酶的杀菌效果,对将其用于生产具有高活力抑菌功能的饲料添加剂具有积极作用。本专利技术所述的基因工程改造的人源溶菌酶不仅对致病菌具有较强的杀灭和抑制作用,同时还具有广谱抗菌的优点,由于抑菌的高效性和对人体的安全性高,也适合于各种食品的防腐。本专利技术采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人源溶菌酶,不受原材料来源的限制,克服了以其它方式获取溶菌酶的成本高、表达量低和比活低的缺点。高比活、低成本溶菌酶的生产与推广应用,不仅可对饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益,同时也可产生巨大的生态效益。附图说明图1:pPIC9K-m5HLM构建图谱。图2:本专利技术所述的人源溶菌酶SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果示意图。具体实施方式人源溶菌酶及突变体酶活测定方法为:利用管蝶法鉴定人源溶菌酶的生物活性,并通过比浊法定量测定人源溶菌酶酶活力大小。管碟法是效仿抗物素的生物学鉴定方法,指示菌为1.5%溶壁微球菌(OD600=1),双蝶制备好后静置10min,在牛津杯中加入样品及阴性对照,24h后观察透明圈的大小。比浊法以溶壁微球菌作为底物,通过菌悬液OD450处吸光度值的变化进行酶活力测定。溶壁微球菌活化及培养步骤参照国标GB/T30990-2014。称取一定量的溶菌酶标品(100000U/mg),用缓冲液稀释成一定的浓度梯度(50-250U/mL),取0.5mL的酶液加入2.5mL的菌悬液混匀,记录在450nm处反应1min时的读数A1,反应2min时的读数A2,计算△E=|A1-A2|的值,以酶活力为纵坐标,△E为横坐标作酶活力标准曲线。同样测定发酵上清液的△E(1min内的变化范围在0.025-0.125),根据酶活力标准曲线计算出发酵上清液的酶活力。发酵液上清的蛋白质含量使用Bradford方法进行测定,用牛血清蛋白作为标样制作标准曲线。将发酵上清稀释到一定倍数,在已加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液的试管中加入100μL稀释的发酵上清液,振荡混匀,室温静置5-10min,于波长在595nm的分光光度计测定吸光值,依据制作的标准曲线算出蛋白浓度,单位mg·mL-1。比活计算为上清液酶活力除以蛋白质含量。下面通过具体实施例对本专利技术所述的耐热人源溶菌酶的基因工程改造过程进行具体说明。实施例1构建融合五肽的溶菌酶表达载体pPIC9K-m5HLM溶菌酶在自然界中大量存在且具有较显著的杀菌效果,为了进一步拓展溶菌酶的抗菌谱和抑菌功能,有必要对溶菌酶进行分子改造以开发出更加适应现代生产需求的新型溶菌酶。对鸡蛋清溶菌酶的研究显示,通过重组技术将疏水短肽连接于蛋清溶菌酶C末端,发现改造的溶菌酶对大肠杆菌杀菌活性显著增强。人源溶菌酶和蛋清溶菌酶都属于c型溶菌酶,因此也对人源溶菌酶C端进行疏水性改造以提高其抗菌效果。选用三种不同长度的疏水短肽进行C末端融合,分别是三肽Val-Leu-Phe,五肽Val-Ile-Pro-Leu-Phe和七肽Val-Ile-Pro-Ala-Ala-Ile-Pro。野生型人源溶菌酶基因HLM根据Pichiapastoris密码子偏好性优化后再通过人工合成获得,具体核苷酸序列见SEQIDNO:1,并整合在pUC57Simple质粒上,得到pUC57Simple-HLM。设计引物F1:ggcGGATCCAAGGTTTTCGAAAGATGTGAACT和引物R1:ggcGCGGCCGCTTAgaacaaagggataccCACACCACA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种比活提高的人源溶菌酶,其特征在于,所述人源溶菌酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种比活提高的人源溶菌酶,其特征在于,所述人源溶菌酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示。


2.一种编码权利要求1所述人源溶菌酶的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示。


3.一种含有权利要求2所述人源溶菌酶基因的载体。


4.如权利要求3所述的载体,其特征在于,所述载体是pPIC9K。


5.一种表达权利要求1所述人源溶菌酶的基因工程菌。


6.如权利要求5所述的基因工程菌,...

【专利技术属性】
技术研发人员:吴丹郑璞陈鹏程张莉芝
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:江苏;32

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