一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1及其应用。本发明专利技术利用反刍动物比较基因组结果，对反刍动物进化的新基因进行扫描，发现了一个反刍动物特异的溶菌酶，且在瘤胃组织中高表达。本发明专利技术利用pPIC9K载体与反刍动物瘤胃特异的溶菌酶LYZ1序列构建出甲醇诱导性毕赤酵母表达菌株，使反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1在毕赤酵母中能够高效的分泌表达，获得的以山羊为代表的溶菌酶LYZ1具有抑制金黄色葡萄球菌的作用，可以作为极具应用潜力、安全的抗菌药物替代物。

A rumen specific lysozyme lyz1 of ruminant and its application

【技术实现步骤摘要】
一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1及其应用
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶1(lysozyme-1,LYZ1)在毕赤酵母中的分泌表达方法及应用。
技术介绍
溶菌酶作为一种天然的抗菌剂，广泛存在于人及哺乳动物等的多种组织器官中，具有抗细菌、真菌及肿瘤等多种药理作用，具有生物相容性好、对组织无刺激性、无毒性的特点，已被制作为一种性质优良、杀伤病原微生物而不破坏机体的酶制剂。溶菌酶根据分子结构和来源不同分为6类：植物溶菌酶、微生物溶菌酶、噬菌体溶菌酶、C型(蛋清溶菌酶、胃溶菌酶)、G型(鹅型溶菌酶)和I型(无脊椎动物溶菌酶)，其中C型、G型和噬菌体溶菌酶最常见。目前为止，已经从反刍动物中鉴定出多种溶菌酶，但仍有许多种类的溶菌酶尚未被发现。而且对于已经制备的溶菌酶(例如，付世新等报道了“牛乳溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析”)，其作为饲料添加剂直接饲喂动物及作为抗生素的替代物的安全性是未知的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1及其应用。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1，该溶菌酶LYZ1的编码序列包括以下DNA序列，或者所述溶菌酶LYZ1的编码序列选自与以下DNA序列具有95％以上同源性的来源于反刍动物基因组的序列：优选的，所述反刍动物选自山羊，山羊的溶菌酶LYZ1的氨基酸序列为：KKFERCELARTLKRLGLDGYRGVSLANWMCLARWESNYNTRATNYNRGDKSTDYGIFQINSRWWCNDGKTPRAVNACRIPCSALLKDDITQAVACAKRVVSDPQGIKAWVAWRNKCQNKDLRSYVKGCRV。优选的，所述溶菌酶LYZ1具有体外抑制金黄色葡萄球菌的活性。上述反刍动物溶菌酶LYZ1在毕赤酵母中的分泌表达方法，包括以下步骤：1)构建毕赤酵母重组菌株利用反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1的编码序列构建重组载体，将重组载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组菌株；2)发酵培养将毕赤酵母重组菌株通过发酵进行重组溶菌酶LYZ1的诱导表达，得到发酵液；3)收集发酵液上清，或将收集的发酵液上清浓缩，得到重组溶菌酶LYZ1蛋白样品。优选的，所述重组溶菌酶LYZ1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。上述反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1在制备抑制革兰氏阳性菌的抗菌药物中的应用。上述反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1在制备抑制金黄色葡萄球菌的抗菌药物中的应用。上述反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1在制备饲料添加剂中的应用。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术通过比较反刍动物基因组获得溶菌酶LYZ1的编码序列，并建立了溶菌酶LYZ1在毕赤酵母中的分泌表达方法，该溶菌酶LYZ1具有抑制革兰氏阳性菌(例如，金黄色葡萄球菌)的作用，而且容易制备和分离纯化，可以作为安全的抗菌药物替代物，极具应用潜力。附图说明图1为实施例重组LYZ1基因表达产物SDS-PAGE电泳图。图2为实施例重组LYZ1蛋白Western-blot检测电泳图。图3为实施例发酵上清液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明，以便于本领域技术人员理解本专利技术，但本专利技术的保护范围并不局限于此。(一)反刍动物特异溶菌酶LYZ1在毕赤酵母中的分泌表达方法1、构建毕赤酵母GS115重组菌株1.1本专利技术利用反刍动物比较基因组结果，对反刍动物进化的新基因进行扫描，发现了一个新的反刍动物特异的溶菌酶，且在瘤胃中特异高表达。根据比较反刍动物基因组鉴定得到的溶菌酶LYZ1氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，得到去除信号肽的重组山羊(Caprahircus)溶菌酶LYZ1基因序列(由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，序列设计完成时间为2018年12月)，如SEQ.ID.NO.1所示。山羊溶菌酶LYZ1重组蛋白的氨基酸序列如下所示(以下第一个氨基酸K为序列氨基端)：KKFERCELARTLKRLGLDGYRGVSLANWMCLARWESNYNTRATNYNRGDKSTDYGIFQINSRWWCNDGKTPRAVNACRIPCSALLKDDITQAVACAKRVVSDPQGIKAWVAWRNKCQNKDLRSYVKGCRVHHHHHH(参见SEQ.ID.NO.4)。1.2利用设计的引物LYZ1-F、LYZ1-R(如SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3所示)，通过Gibson连接方法(Gibson,D.G.etal.，2009)，将重组山羊溶菌酶LYZ1基因序列构建于pPIC9K表达载体(购自Invitrogen公司)，获得重组载体pPIC9K-LYZ1。LYZ1-F：5'-TACGTAGAATTCAAGAGAAAAAAGTTCGAAAGATGTGAATTGGCT-3'LYZ1-R：5'-ATGGTGATGATGATTCGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAACTCTA-3'Gibson连接体系配制(1)准备5×ISObuffer，5×ISObuffer组分配比如下表所示：(2)配制Mastermixture，Mastermixture组分配比如下表所示：(3)Gibson组装体系配制及反应条件，Gibson组装体系如下表所示：其中，载体片段和插入片段的总量不能超过200ng。整体体积不能超过20μL，如果片段体积和原mix溶液体积已经达到20μL，可以不加超纯水。Gibson组装方案：将片段加入Gibsonmix中后，补水至20μL，混匀，放入50℃环境内，反应1h后经过DMT消化，纯化，然后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞内。也可不经过DMT消化，直接纯化后转化入大肠杆菌DMT感受态细胞内。pPIC9K-LYZ1质粒提取采用天根质粒小提中量试剂盒。1.3制备毕赤酵母GS115感受态细胞在YPD固体平板上挑取P.pastorisGS115(西北工业大学实验室保存)单克隆，接种到5mL新鲜的YPD液体培养基中，30℃摇床培养。待菌体生长至OD600～1.0，转接至100mLYPD摇瓶中，30℃、200rmp摇床培养。待菌体生长至OD600～1.0，在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入100mL冰水，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入50mL冰水，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入4mL冰山梨醇(1M)，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入2mL冰山梨醇(1M)，重悬，收集备用。1.4将待转化的pPIC9K-LYZ1质粒利用SacI限制性内切酶进行线性化，电转化至毕赤酵母GS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1，其特征在于：该溶菌酶LYZ1的编码序列包括以下DNA序列，或者所述溶菌酶LYZ1的编码序列选自与以下DNA序列具有95％以上同源性的来源于反刍动物基因组的序列：/n

【技术特征摘要】
1.一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1，其特征在于：该溶菌酶LYZ1的编码序列包括以下DNA序列，或者所述溶菌酶LYZ1的编码序列选自与以下DNA序列具有95％以上同源性的来源于反刍动物基因组的序列：





2.根据权利要求1所述一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1，其特征在于：所述反刍动物选自山羊，山羊的溶菌酶LYZ1的氨基酸序列为：
KKFERCELARTLKRLGLDGYRGVSLANWMCLARWESNYNTRATNYNRGDKSTDYGIFQINSRWWCNDGKTPRAVNACRIPCSALLKDDITQAVACAKRVVSDPQGIKAWVAWRNKCQNKDLRSYVKGCRV。


3.根据权利要求1所述一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1，其特征在于：所述溶菌酶LYZ1具有体外抑制金黄色葡萄球菌的活性。


4.一种如权利要求1所述的反刍动物瘤胃特异溶菌酶L...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜雨，潘香羽，陈贤情，王文，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61