一种深海来源的壳聚糖酶CSN5及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种壳聚糖酶CSN5及其编码基因和应用，属于生物工程技术领域，本发明专利技术提供了壳聚糖酶CSN5氨基酸序列和编码所述酶的核苷酸序列及其应用、含有所述基因的重组质粒CSN5/pET‑28a、含有该重组质粒的基因工程菌株以及该基因工程菌株的应用。本发明专利技术的壳聚糖酶CSN5具有优良的酶学特性：最适温度为30℃，在20‑40℃具有较高活性；最适pH为7，在pH 6‑7的条件下酶活较高，可以保持60％以上的活性。其反应条件温和，在酶法制备壳寡糖中具有很好的工业应用前景。

A deep sea chitosanase CSN5 and its coding gene and Application

【技术实现步骤摘要】
一种深海来源的壳聚糖酶CSN5及其编码基因和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种深海淤泥来源的壳聚糖酶CSN5及其编码基因和应用。
技术介绍
壳聚糖是由自然界中广泛存在的甲壳素脱乙酰化后的产物，大量的研究表明壳聚糖在化工、医药、食品和农业等领域都有广泛的应用。相较于壳聚糖，其降解产物壳寡糖分子量小，可溶于水，具有优越的生物活性，非常容易被人体吸收，也是目前发现的自然界中唯一带正电荷的碱性寡糖，极具开发价值。目前，降解壳聚糖制备壳寡糖的方法主要有酶降解法、物理和化学降解法。酶降解法因反应过程更易控制。反应条件温和、专一性强、产物相对均一安全性高、环境污染少等优势而广受关注。壳聚糖酶可以催化水解壳聚糖的β-1,4-糖苷键，是专一性水解壳聚糖的酶，广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中，在降解壳聚糖多聚物、制备壳寡糖中发挥着重要作用。因此需要不断尝试新的方法来获取具有优异性质的新型壳聚糖酶以满足日益增长的需求。各种环境中的微生物是新酶和生物活性分子的重要来源，但在微生物多样化的地球中，采用可培养技术能获得的微生物不足1％，这已成为微生物资源开发利用的一个限制性因素。与之相反，占大多数的不可培养微生物(>99％)，代表着生物技术开发应用的巨大基因库。宏基因组学，作为一种不依赖于培养的技术，通过提取特定环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库，从文库中筛选和发现新的功能基因。宏基因组学的方法已被成功用于多种工业酶类的开发，它避开了微生物分离培养的过程，因此，利用宏基因组学的方法开发挖掘新型壳聚糖酶资源具有广阔的发展前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种壳聚糖酶CSN5及其编码基因和应用，所述壳聚糖酶基因csn5来源于深海淤泥宏基因组。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种壳聚糖酶CSN5，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供编码所述壳聚糖酶CSN5的基因csn5，其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。本专利技术的另一个目的在于提供一种重组质粒csn5/pET-28a，所述重组质粒csn5/pET-28a含有上述壳聚糖酶CSN5的基因csn5。本专利技术还提供含有所述重组质粒csn5/pET-28a的基因工程菌株。进一步，所述的重组质粒csn5/pET-28a表达载体优选为pET28a。进一步，所述的基因工程菌株由所述的重组质粒csn5/pET-28a转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)获得。本专利技术还提供上述壳聚糖酶CSN5用于催化壳聚糖生产壳寡糖的应用。本专利技术还提供上述基因工程菌株用于催化壳聚糖生产壳寡糖的应用。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术从深海淤泥中提取了壳聚糖酶基因csn5，其编码的壳聚糖酶CSN5的氨基酸序列与GenBank中Geobacteraceaebacterium来源的肽聚糖结合蛋白具有最高的相似性，为60％。本专利技术同时构建了该壳聚糖酶CSN5的基因csn5的重组质粒csn5/pET-28a及基因工程菌株，所产生的壳聚糖酶CSN5具有优良的酶学特性：最适温度为30℃，在20-40℃具有较高活性；最适pH为7，在pH6-7的条件下酶活较高，可以保持60％以上的活性。其反应条件温和，在酶法制备壳寡糖中具有很好的工业应用前景。附图说明图1：壳聚糖酶CSN5纯酶SDS-PAGE电泳图，M为Marker。图2：温度对纯化的壳聚糖酶CSN5酶活力的影响。图3：pH对纯化的壳聚糖酶CSN5酶活力的影响。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了一种壳聚糖酶CSN5，编码该壳聚糖酶CSN5的基因CSN5及其应用、含有该基因的重组质粒CSN5/pET-28a、含有该重组质粒的基因工程菌株以及该基因工程菌株的应用。实施例1、来源于深海淤泥壳聚糖酶CSN5编码基因的获取本专利技术的壳聚糖酶CSN5编码基因的获取方法包括如下步骤：(1)、构建深海淤泥宏基因组文库构建宏基因组文库的样品来自深海淤泥，按照Meta-G-NomeTMDNAIsolationKit(Epicentre)说明书提取并纯化宏基因组样品DNA。取适量纯化的DNA，载体采用CopyControlTMFosmidLibraryProductionKitwithpCC1FOSTMVector(Epicentre)，与其连接后将连接液转入EPI300TM-T1RE.coli宿主菌中。然后涂布在平板上(含12.5mg/L氯霉素)，37℃过夜培养后用无菌LB洗下平板上的菌落，加甘油(20％，v/v)保存于-80℃。(2)筛选壳聚糖酶的阳性克隆将保存的菌液按照适当的稀释倍数涂布在含壳聚糖(0.1％)的培养基上(含12.5mg/L氯霉素)，37℃恒温培养24-48h后，观察菌落周围培养基变化，挑取能形成清晰透明圈的菌株，并重复划线进行活性确认，将获得的阳性菌株命名为1-CSN5。(3)构建亚克隆文库及筛选阳性亚克隆依据碱裂解法提取筛选到的阳性克隆1-CSN5的质粒，并用限制性内切酶Sau3AI将其片段化，采用琼脂糖电泳分离，并将大小为2-5kb的DNA片段切胶回收。然后与用限制性内切酶BamHI酶切后的质粒pBluescriptIISK(+)片段连接并转入大肠杆菌DH5α中，构建亚克隆文库，筛选方法与如上所述一致，观察菌落周围的透明圈进行挑选，并经划线重复确认，将获得等阳性亚克隆菌株命名为2-CSN5。(4)基因测序及壳聚糖酶CSN5的基因序列分析将筛选得到的阳性亚克隆菌株CSN5进行测序，并将测序结果利用NCBI/ORFFinder进行在线分析，得到一个全长为1116bp的完整开放阅读框，将其命名为csn5，其详细序列如SEQIDNO:2所示。编码蛋白长度为371个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。将该氨基酸序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高为62％的是一个来源于Blastocatelliabacterium的假设蛋白。(5)壳聚糖酶CSN5基因的克隆及重组表达根据序列分析结果，设计带有酶切位点的引物扩增壳聚糖酶CSN5全基因，引物序列如下：CSN5BF：5'cgcggatccatggggtttagctca3'(下划线部分为BamHI酶切位点)；CSN5SR：5'cgagctctcatatcgtctccttta3'(下划线部分为SacI酶切位点)。利用上述引物，将壳聚糖酶CSN5的基因进行PCR扩增，然后将产物用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，酶切产物经纯化后与经相同双酶切过的原核表达载体pET-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种壳聚糖酶CSN5，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖酶CSN5，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.编码权利要求1所述壳聚糖酶CSN5的基因csn5，其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。


3.一种重组质粒csn5/pET-28a，所述重组质粒csn5/pET-28a含有权利要求2所述壳聚糖酶CSN5的基因csn5。


4.权利要求3所述的一种重组质粒csn5/pET-28a，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙慧慧，杨国淞，刘淇，毛相朝，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37