水产病原菌糖酵解途径中持家酶的广谱组合型疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其是以至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而形成的重组蛋白作为抗原成分。本发明专利技术还公开了所述水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗在防治水产病原菌对鱼类的感染中的应用。本发明专利技术的广谱组合型疫苗，其是将具有免疫活性的多肽片段PGK

【技术实现步骤摘要】
水产病原菌糖酵解途径中持家酶的广谱组合型疫苗及其应用
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，是关于一种水产病原菌糖酵解途径中持家酶的广谱组合型疫苗及其应用。
技术介绍
近几十年，我国渔业发展迅速，水产品总产量位居世界前列，我国已成为世界上水产品生产、消费和进出口大国。由于市场需求增大，集约化养殖程度的提高成了必然发展，同时越来越多的人认识到微生物疾病不仅仅局限于一种病原体，如病毒、细菌、真菌和寄生虫等的各种组合方式，其中一种微生物的存在会为其他病原性微生物的感染提供便利，从而共同导致疾病，这种引发疾病的方式是多病原微生物感染。同样，多病原感染方式在水产养殖中也是普遍存在的，这就加剧了鱼类病害的严重性，给我国的水产养殖业带来了巨大的损失。我国的水产养殖中也存在一些问题，如各种化学药物的滥用则会导致水产品的药物残留超标，不仅仅对环境造成了污染，而且影响水产品的食品安全，限制了我国水产品的出口。针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物残留等负面影响日趋严重。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已经被禁用。于是，我国对水产疫苗的关注越来越高。疫苗不仅能够增强动物的免疫力，预防相关疾病的发生，还能减少各类药物的使用，降低养殖成本，解决各种药物残留带来的食品安全问题、环境污染问题，使水产养殖业向着绿色的、可持续发展的方向前进。细菌是水产养殖中最常见的病原菌，给水产养殖造成了巨大损失，如鳗弧菌、哈维弧菌、迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、柱状纤维菌、溶藻弧菌等。在强致病性细菌中，运动性气单胞菌和爱德华氏菌属是最主要的。迟钝爱德华氏菌(Edwaedsiellatarda)的传播面积广，无明显季节性，感染率及死亡率高，危害的种类多，有鲶鱼、鲤鱼、罗非鱼、鳗鱼、鲻鱼和大菱鲆等大多数具有较高经济价值的鱼种，并引起大面积死亡。迟钝爱德华氏菌感染大菱鲆后，发病症状表现为鱼体后部的背侧皮肤发黑、腹部出现红肿和肾脏肿大。病理学分析发现迟钝爱德华氏菌对大菱鲆的感染是系统性的，尤其是肾脏病变明显，而巨噬细胞在多个器官中增值聚集并产生肉芽肿瘤。此外，迟钝爱德华氏菌还感染贝类、爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类。值得注意，迟钝爱德华氏菌还是一种重要的人畜共患病原菌，它是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员。目前，在我国养殖鱼类爱德华氏菌病病害比较严重的病原体主要为迟钝爱德华氏菌，并有存在病原体向人体转移的巨大威胁。目前在我国尚无该病害的有效防治措施。目前，爱德华氏菌的控制主要依靠抗生素的使用，以化学治疗为主。由于抗生素能被不断的耐受，它们在水产养殖中的应用越来越受到限制。此外，致病的迟钝爱德华氏菌常常被发现对多重抗菌素复合物有自然抗性，增加了以抗生素为基础的治疗的难度。相比之下，从一个长期的观点来看，疫苗是疾病控制更安全更有效的方法。由于灭活疫苗的抗原性较弱，而减毒疫苗的安全性不稳定，为此，研制使用方便、高效、易商品化大规模生产、切实有效的亚单位疫苗，对水产业尤为必要。糖酵解持家酶普遍存在于生物体内，参与基础代谢，不同物种间同源度高。这些糖酵解持家酶的免疫原性也被日益关注，正逐渐成为疫苗设计的新靶点。鉴于此，开发新型的效果较好的疫苗成为迫切需要，优选迟钝爱德华氏菌糖酵解持家酶蛋白作为优选抗原蛋白，为后续设计多病原免疫防治的疫苗奠定基础。
技术实现思路
本专利技术人研究发现将糖酵解途径(EMP途径)中的酶作为候选疫苗蛋白，进而优选抗原蛋白双组分和三组分等进行联合免疫，筛选协同免疫的抗原组合；同时进行优选抗原蛋白关键表位肽的筛选，对获得的关键表位肽进行串联表达、纯化及免疫保护力评价，免疫斑马鱼所获得的实验结果进一步发现不同关键表位的组合方式产生不同免疫效果，为后续微藻中抗原蛋白的联合表达提供基础。因此本专利技术文对获得的抗原蛋白开展多组分联合免疫效力评价、关键表位肽的鉴定和串联重组表达，以期获得优选高效抗原。为此，本专利技术的第一个目的在于提供一种水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，用于防治多种水产病原菌对鱼类的感染。本专利技术的第二个目的是提供所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗的应用。为了达到上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：作为本专利技术的第一个方面，一种水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其是以至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而形成的重组蛋白作为抗原成分。根据本专利技术，糖酵解途径来源的持家酶为PGM、PGK、ENO、HK，所述PGM、PGK、ENO、HK的关键表位分别为多肽PGM1、PGK2与PGK3、ENO1以及HK3，所述PGM1是具有蛋白PGM相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述PGK2是具有蛋白PGK相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述PGK3是具有蛋白PGK相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述ENO1是具有蛋白ENO相对应的第1-108位氨基酸的多肽片段，所述HK3是具有蛋白HK相对应的第161-240位氨基酸的多肽片段，所述蛋白PGK、PGM、ENO、HK的氨基酸序列分别如SEQIDNo:1、SEQIDNo:2、SEQIDNo:3、SEQIDNo:4所示。根据本专利技术，所述蛋白PGK、PGM、ENO、HK的编码基因分别具有如SEQIDNo:5、SEQIDNo:6、SEQIDNo:7、SEQIDNo:8所示的核苷酸序列。较佳的，所述水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其是以糖酵解途径来源的持家酶PGM和PGK的关键表位相连接而成的重组蛋白作为抗原成分。根据本专利技术，所述PGM、PGK关键表位分别为PGM1、PGK2与PGK3,所述PGM1是具有蛋白PGM相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述PGK2是具有蛋白PGK相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述PGK3是具有蛋白PGK相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述蛋白PGK、PGM的氨基酸序列分别如SEQIDNo:1、SEQIDNo:2所示，其对应的编码基因分别具有如SEQIDNo:5、SEQIDNo:6所示的核苷酸序列。根据本专利技术，所述重组蛋白在大肠杆菌中表达。根据本专利技术，所述的水产病原菌包括鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌、美人鱼发光杆菌、鲁氏耶尔森菌。作为本专利技术的第二个方面，一种如上述所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗在防治水产养殖中的细菌性病害中的应用。进一步的，所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗在防治鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌等引起的水产养殖中的细菌性病害中的应用。根据本专利技术，所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗用于防治鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌等水产病原菌对鱼类的共感染，所述的水产病原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其特征在于，其是以至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而形成的重组蛋白作为抗原成分。/n

【技术特征摘要】
1.一种水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其特征在于，其是以至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而形成的重组蛋白作为抗原成分。


2.如权利要求1所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其特征在于，糖酵解途径来源的持家酶为PGM、PGK、ENO、HK，所述PGM、PGK、ENO、HK的关键表位分别为PGM1、PGK2与PGK3、ENO1以及HK3，所述PGM1是具有蛋白PGM相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述PGK2是具有蛋白PGK相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述PGK3是具有蛋白PGK相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述ENO1是具有蛋白ENO相对应的第1-108位氨基酸的多肽片段，所述HK3是具有蛋白HK相对应的第161-240位氨基酸的多肽片段，所述蛋白PGK、PGM、ENO、HK的氨基酸序列分别如SEQIDNo:1、SEQIDNo:2、SEQIDNo:3、SEQIDNo:4所示。


3.如权利要求1所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其特征在于，其是以糖酵解途径来源的持家酶PGM和PGK的关键表位相连接而成的重组蛋白作为抗原成分；
所述PGM、PGK关键表位分别为PGM1、PGK2与PGK3,所述PGM1是具有蛋白PGM相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述PGK2是具有蛋白PGK相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述PGK3是具有蛋白PGK相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述蛋白PGK、PGM的氨基酸序列分别如SEQIDNo:1、SEQIDNo:2所示，所对应的编码基因序列分别具有如SEQIDNo:5、SEQIDNo:6所示的核苷酸序列。


4.如权利要求1-3任一项所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其特征在于，所述的水产病原菌包括鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌、美人鱼发光杆菌、鲁氏耶尔森菌。


5.一种如权利要求1-3任一项所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗在防治水产养殖中的细菌性病害中的应用。


6.一种重组蛋白，其特征在于，其是通过将至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而成，所述糖酵解途径来源的持家酶为PGM、PGK、ENO、HK，所述PGM、PGK、ENO、HK的关键表位分别为PGM1、PGK2与PGK3、ENO1以及HK3，所述PGM1是具有蛋白PGM相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述PGK2是具有蛋白PGK相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述PGK3是具有蛋白PGK相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述ENO1是具有蛋白ENO相对应的第1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海珍，范建华，包秋文，马可，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31