一种鼠疫减毒活疫苗干粉剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鼠疫减毒活疫苗干粉剂的制备方法。本发明专利技术提供的鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法，包括：将鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株、冻干保护剂(脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐‑40、甘油、尿素)、储藏保护剂(谷氨酸钠和硫脲组)、分散剂(亮氨酸和泊洛沙姆)和去离子水混合，得到含有菌体的混合液；真空冷冻干燥。利用本发明专利技术方法所得到的鼠疫减毒疫苗干粉片状固体，含水量低，吸湿能力弱，利于保存和运输，水溶解性好，为下一步可吸入减毒活疫苗的干粉化制备和干粉气溶胶给药提供了可行性。

A preparation method of live attenuated plague vaccine powder

【技术实现步骤摘要】
一种鼠疫减毒活疫苗干粉剂的制备方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种鼠疫减毒活疫苗干粉剂的制备方法。
技术介绍
鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的自然疫源性疾病，通常在啮齿动物之间流行，偶尔能引起人间流行。鼠疫传播属于国际检疫传染病，也是我国《传染病法》规定的甲类传染病之首。我国一直对鼠疫进行严密的监控，尤其是鼠疫的自然疫源地，防止鼠疫在我国的传播。鼠疫起病急、病程短、死亡率高、传染性强、容易引起人群中大规模传播。特别是败血性鼠疫和肺鼠疫，如果不加治疗，病死率为30％-100％。鼠疫潜伏期较短，一般为1-6天，但个别病例可达8-9天。对于疫区从事野外工作的人或猎杀、剥食旱獭的猎人、牧民接触染疫动物可能性大，感染的可能性高于一般人群。因此对于疫区的居民，疫苗接种是非常重要的保护手段。但传统的经皮或经肌肉注射接种，与直接肺部免疫接种相比，缺乏呼吸道和肺部黏膜免疫应答，对气溶胶吸入感染的免疫保护效果较差，因此肺部免疫接种被认为是针对气溶胶感染的重要免疫途径。研究表明粉剂较液剂能引发更强的黏膜免疫反应，原因可能是液态疫苗被递送入肺后很快被黏膜系统的清除运动排出体外，而干粉疫苗被递送入肺后在局部的黏附力较好，从而延缓了黏膜对其清除速度。气溶胶化的疫苗干粉经肺吸入免疫接种后不仅诱导全身免疫应答，通常还可诱导传统免疫接种途径欠缺的呼吸道和肺部黏膜免疫应答，因而相比于传统免疫接种，干粉疫苗对吸入感染防护效果可起到更好或相等的作用。目前国内外的研究中，对于鼠疫减毒活疫苗的干粉制备仍没有相关报道。专利技术内容本专利技术的目的是提供一种生物活性较好，适合长期保存且便于携带的鼠疫减毒疫苗干粉剂，并为后续可吸入减毒活疫苗的干粉化制备和干粉气溶胶给药奠定基础。第一方面，本专利技术要求保护一种鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法。本专利技术所要求保护的鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法，可包括如下步骤：(A1)将鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株、冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和去离子水混合，得到含有菌体的混合液。所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成。(A2)将(A1)所得含有菌体的混合液进行真空冷冻干燥，得到鼠疫减毒疫苗的干粉制剂。在所述混合液中，所述脱脂乳、所述甘油和所述泊洛沙姆的体积配比为1：1：0.1。在所述混合液中，所述海藻糖、所述肌醇、所述右旋糖酐-40、所述尿素、所述谷氨酸钠、所述硫脲和所述亮氨酸的质量配比可为：6：0.5：0.5：0.1：0.5：0.5：0.5。进一步地，在所述混合液中，所述脱脂乳的体积百分含量可为0.5％，所述海藻糖的质量百分含量可为6.0％，所述肌醇的质量百分含量可为0.5％，所述右旋糖酐-40的质量百分含量可为0.5％，所述甘油的体积百分含量可为0.5％，所述尿素的质量百分含量可为0.1％，所述谷氨酸钠的质量百分含量可为0.5％，所述硫脲的质量百分含量可为0.5％，所述亮氨酸的质量百分含量可为0.5％，所述泊洛沙姆的体积百分含量可为0.05％。进一步地，在所述混合液中，所述鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株的含量需大于109CFU/mL，具体如(2～4)×109CFU/ml。在步骤(A2)中，所述真空冷冻干燥可为程序性真空冷冻干燥；所述程序性真空冷冻干燥可按照如下程序进行：(a1)一次干燥：真空设置为220mTorr，板层温度-35℃，冷阱-80℃，干燥48小时；(a2)一次干燥结束后，将板层温度更改为-15℃，进行二次干燥，干燥12h。在本专利技术的具体实施方式中，所述程序性真空冷冻干燥具体是在程序性真空冷冻干燥机(如Advantage实验室冻干机，型号为SPScientific，XL)中进行的。在进行前文所述程序性真空冷冻干燥步骤(a1)前，还可包括将所述程序性真空冷冻干燥机预冻至少一个小时(板层设置温度为﹣40℃)的步骤。进一步地，步骤(A2)中，将(A1)所得含有菌体的混合液进行真空冷冻干燥前还可包括将(A1)所得含有菌体的混合液进行预冷冻的步骤。更进一步地，所述预冷冻可为4℃预冻3h，后转入-20℃冷冻24小时。第二方面，本专利技术要求保护用于制备鼠疫减毒疫苗干粉剂的赋形剂溶液。本专利技术要求保护的用于制备鼠疫减毒疫苗干粉剂的赋形剂溶液，可由冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和去离子水混合而成。其中，所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成。在所述赋形剂溶液中，所述脱脂乳、所述甘油和所述泊洛沙姆的体积配比为1：1：0.1。在所述赋形剂溶液中，所述海藻糖、所述肌醇、所述右旋糖酐-40、所述尿素、所述谷氨酸钠、所述硫脲和所述亮氨酸的质量配比可为：6：0.5：0.5：0.1：0.5：0.5：0.5。进一步地，所述赋形剂溶液可以工作液或母液形式存在。在所述工作液中，所述脱脂乳的体积百分含量可为0.5％，所述海藻糖的质量百分含量可为6.0％，所述肌醇的质量百分含量可为0.5％，所述右旋糖酐-40的质量百分含量可为0.5％，所述甘油的体积百分含量可为0.5％，所述尿素的质量百分含量可为0.1％，所述谷氨酸钠的质量百分含量可为0.5％，所述硫脲的质量百分含量可为0.5％，所述亮氨酸的质量百分含量可为0.5％，所述泊洛沙姆的体积百分含量可为0.05％。所述母液的组成与所述工作液的浓缩液相同，相当于各组分的浓度在上述基础上同时增大若干倍，如2×母液或10×母液等，使用时再进行稀释(如以去离子水进行稀释)。第三方面，本专利技术要求保护前文第二方面所述的赋形剂溶液在制备鼠疫减毒疫苗干粉剂中的应用。在本专利技术的具体实施方式中，所述鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株具体为鼠疫菌201株。在本专利技术的具体实施方式中，所述脱脂乳可按照包括如下步骤的方法制备得到：鲜牛奶(如市售三元牌袋装鲜牛奶)离心(如4℃下8000×g离心10min)后，弃去上层油脂和下层沉淀，将中间层脱脂乳转至新的离心管(本步骤可共进行3次)。然后将中间层脱脂乳在沸水中煮沸1h，室温放置。在接下来的三天，每天将中间层脱脂乳在沸水中煮沸一小时。最后，4℃下8000×g离心10min，弃去上层残留油脂和下层残留沉淀，将中间层脱脂乳转至新的离心管，得到的脱脂乳溶质体积百分比为10％。实验证明，利用本专利技术方法所得到的鼠疫减毒疫苗干粉片状固定，含水量低，吸湿能力弱，利于保存和运输，水溶解性好，为下一步可吸入减毒活疫苗的干粉化制备和干粉气溶胶给药提供了可行性。附图说明图1为程序性真空冷冻干燥法制备的样品和普通冷冻干燥法制备的样品。A为程序性真空冷冻干燥法制备的样品；B为普通冷冻干燥法制备的样品。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法，包括如下步骤：/n(A1)将鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株、冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和水混合，得到含有菌体的混合液；/n所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；/n所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；/n所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成；/n(A2)将(A1)所得含有菌体的混合液进行真空冷冻干燥，得到鼠疫减毒疫苗的干粉制剂。/n

【技术特征摘要】
20200330 CN 20201023543791.一种鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法，包括如下步骤：
(A1)将鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株、冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和水混合，得到含有菌体的混合液；
所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；
所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；
所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成；
(A2)将(A1)所得含有菌体的混合液进行真空冷冻干燥，得到鼠疫减毒疫苗的干粉制剂。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述混合液中，所述脱脂乳、所述甘油和所述泊洛沙姆的体积配比为1：1：0.1；和/或
在所述混合液中，所述海藻糖、所述肌醇、所述右旋糖酐-40、所述尿素、所述谷氨酸钠、所述硫脲和所述亮氨酸的质量配比为：6：0.5：0.5：0.1：0.5：0.5：0.5。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述混合液中，所述脱脂乳的体积百分含量为0.5％，所述海藻糖的质量百分含量为6.0％，所述肌醇的质量百分含量为0.5％，所述右旋糖酐-40的质量百分含量为0.5％，所述甘油的体积百分含量为0.5％，所述尿素的质量百分含量为0.1％，所述谷氨酸钠的质量百分含量为0.5％，所述硫脲的质量百分含量为0.5％，所述亮氨酸的质量百分含量为0.5％，所述泊洛沙姆的体积百分含量为0.05％。


4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在所述混合液中，所述鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株的含量大于109CFU/mL。


5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A2)中，所述真空冷冻干燥为程序性真空冷冻干燥；所述程序性真空冷冻干燥按照如下程序进行：
(a1)一次干燥：真空设置为220mTorr...

【专利技术属性】
技术研发人员：周冬生，杨文慧，曹超越，胡凌飞，赵月峨，孙岩松，邱业峰，熊小路，杨慧盈，殷喆，焦俊，于学东，李越，张丽丽，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11