美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗及其制备方法。1.通过筛选存在致病力和免疫原差异的两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，分别进行全菌灭活后添加枸杞多糖混合制成。本发明专利技术对海水鱼类的免疫保护效果突出，可有效防控对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的感染。

【技术实现步骤摘要】
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗及其制备方法
：本专利技术属于海水养殖病害防控
，具体涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗及其制备方法。
技术介绍
：美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacteriumdamselaesubsp.damselae)是弧菌科发光杆菌属细菌美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)的一个亚种，由美国科学家Love等人首次报道于1981年的Science杂志，分离自患皮肤溃疡病的雀鲷科鱼类Chromispunctipinnis皮肤病灶处。随后，世界各地陆续有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟等不同海洋动物发病的案例。此外，该菌还可以感染鲸豚类等海洋哺乳动物发病，对人类也具有极强的致病力，可以感染人类导致严重的筋膜炎或败血症而死亡，是一种少见的分布于海洋环境中的人鱼共患病原。到目前为止，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种在我国感染海水养殖动物发病的报道相对比较少见，因此也被认为是我国海水养殖近几年的新发病原之一。但从最新的流行病学调查显示，该菌可以感染卵形鲳鲹、石斑鱼、大菱鲆、半滑舌鳎、许氏平鲉等南北方的多种海水养殖鱼类，流行面积有不断扩大的趋势，对我国的海水养殖渔业生产安全构成了重大威胁。近五年来，本研究团队针对该菌进行了持续性的流行病学调查，在我国山东、河北、江苏、海南等地收集了30余株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株。病原学的研究结果表明，这些菌株不仅生理生化指标、抗生素药物敏感性、溶血特性等生理生化表型特征存在较明显的差异，对鱼类的致病力也存在着极为明显的差异。同时，初步的免疫研究结果也发现，不同致病力菌株的鸡源抗体相互之间不发生玻片凝集反应，证明不同美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株之间存在着免疫原差异性。目前，防控鱼类疾病效率高、成本低的技术途径，依然是制备疫苗进行免疫预防。防控，仍然是应对。从前期的流行病学调查结果中已经可以确定，PDD常年、高丰度的分布于我国多地的养殖海域中，但菌株免疫原存在差异性。因此，运用美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的不同菌株制备多价的全菌灭活疫苗，对有效防控该菌具有重要的意义。
技术实现思路
：本专利技术要解决的技术问题是针对不同的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株存在致病力和免疫原差异性，提供一种多价的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活疫苗，它是由经过筛选的、不同的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株灭活后添加枸杞多糖制备而成，可以为养殖生产中防控不同株型美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的感染提供保障技术。为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，通过筛选存在致病力和免疫原差异的两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，分别进行全菌灭活后添加枸杞多糖混合制成。进一步，所述的两株致病力和免疫原差异菌株分别是保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为：CGMCCNo.19466(保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年3月12日)的无致病力菌株(Photobacterium.damselaesubsp.damselae)存活菌株Pdd0909；以及保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为：CGMCCNo.19467(保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年3月12日)的强致病力菌株(Photobacterium.damselaesubsp.damselae)存活菌株Pdd1605。进一步，这两株菌的全菌灭活方式是通过以下方法实现的：(1)活化菌株；(2)挑选单克隆菌落，培养种子液；(3)制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株发酵液；(4)离心后去除上清液，然后对菌体进行重悬，然后灭活；(5)再次离心后去除上清液收集菌体，调整浓度，得到全菌灭活菌液；(6)各取两株菌检验合格的灭活菌液，混合后制备成人鱼发光杆菌美人鱼亚种的多价灭活菌液；(7)取纯品枸杞多糖溶解，得到枸杞多糖溶液；(8)将(6)中的多价灭活菌液、(7)中的枸杞多糖溶液和缓冲液混合，并震荡均匀，最终制得美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗。进一步的，检验菌落是否合格的方法如下：吸取制好的灭活菌液100μl涂布于TSB琼脂培养基在28℃培养24h，进行三次平行实验，检验灭活效果，若无菌落长出，证明灭活菌液合格。进一步的，步骤(1)活化菌种的培养条件为从-80℃保存的菌种盒中活化两株菌的菌种，在28℃的条件下，用TSB琼脂平板培养基单菌落纯化培养3次，每次培养时间为20-22h；不低于20h，不超过24h；步骤(2)培养种子液的条件为从TSB琼脂平板培养基上挑选纯化好的一个单克隆菌落，接种至5mlTSB液体培养基中，在28℃、180rmp/min震荡条件下，培养10-12h，作为种子液。进一步的，步骤(3)发酵的具体操作为：吸取300ul上述培养好的种子液转接至500mlTSB液体培养基种，在28℃、180rmp/min震荡条件下，培养16-20h；吸取5ml进行梯度稀释测定吸光值(OD600)，按照Y＝(0.6518X-0.0158)×109cfu/ml公式计算发酵液中活菌浓度值，公式中X为OD600的数值，Y为发酵液活菌浓度，OD600取值仅在0.2～0.8范围内有效。当菌液浓度达到109cfu/ml或以上时，停止发酵，制成美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株发酵液。进一步的，步骤(4)灭活的具体操作为：用两个50ml的离心管，在8000rmp/min条件下离心5min后倒去上清液，分5次将制备好的500ml发酵液中的菌体收集至两个离心管中；收集完毕后，分别在两个离心管中各加入40ml的1.5％无菌NaCl溶液，对菌体进行重悬，并将两个离心管中的重悬菌液转移至一个高温灭菌的250ml锥形瓶中，补充20ml的1.5％无菌NaCl溶液至总体积为100ml，再加入0.5ml甲醛使其浓度达到0.5％，然后在4℃、90rmp/min灭活48h。进一步的，步骤(5)的具体操作为：将灭活完成菌液在8000rmp/min条件下离心5min后倒去上清液，收集菌体。依据(2-3)计算的菌液浓度值和体积倍比关系，加入适量的体积0.2％甲醛溶液，最终调整灭活菌液浓度为2.0～4.0×1010cfu/ml，分别制得两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的全菌灭活菌液，存放于4℃备用。进一步的，步骤(6)具体为各取1ml两株菌检验合格的灭活菌液，混合后制备成2ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的多价灭活菌液，存放于4℃备用；步骤(7)具体为取纯品枸杞多糖400mg，溶解于20ml的PBS缓冲液中(PH＝7.2)，在105℃灭菌30min后，自然冷却制得20mg/ml的枸杞多糖溶液。进一步，步骤(8)为将上述2ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活菌液、10ml的枸杞多糖溶液和8ml的无菌PBS缓冲液(PH＝7.2)进行混合，并震荡均匀，最终制得美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗。一种利用上述方法制备的美人鱼发光杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：通过筛选存在致病力和免疫原差异的两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，分别进行全菌灭活后添加枸杞多糖混合制成。/n

【技术特征摘要】
1.一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：通过筛选存在致病力和免疫原差异的两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，分别进行全菌灭活后添加枸杞多糖混合制成。


2.如权利要求1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：所述的两株致病力和免疫原差异菌株分别是保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为：CGMCCNo.19466(保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的无致病力菌株，以及保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为：CGMCCNo.19467(保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的强致病力菌株。


3.如权利要求1或2所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)活化菌株；
(2)挑选单克隆菌落，培养种子液；
(3)制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株发酵液；
(4)离心后去除上清液，然后对菌体进行重悬，然后灭活；
(5)再次离心后去除上清液收集菌体，调整浓度，得到全菌灭活菌液；
(6)各取两株菌检验合格的灭活菌液，混合后制备成人鱼发光杆菌美人鱼亚种的多价灭活菌液；
(7)取纯品枸杞多糖溶解，得到枸杞多糖溶液；
(8)将(6)中的多价灭活菌液、(7)中的枸杞多糖溶液和缓冲液混合，并震荡均匀，最终制得美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗。


4.如权利要求3所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：吸取制好的灭活菌液涂布于TSB琼脂培养基进行培养，进行三次平行实验，检验灭活效果，若无菌落长出，证明灭活菌液合格。


5.如权利要求3所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)活化菌种的培养条件为从-80℃保存的菌种盒中活化两株菌的菌种，在28℃的条件下，用TSB琼脂平板培养基单菌落纯化培养3次，每次培养时间为20-22h；不低于20h，不超过24h；步骤(2)培养种子液的条件为从TSB琼脂平板培养基上挑选纯化好的一个单克隆菌落，接种至5mlTSB液体培养基中，在28℃、180rmp/min震荡条件下，培养10-12h，作为种子液。


6.如权利要求3所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)发酵的具体操作为：吸取300ul上述培养好的种子液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正，于永翔，王印庚，王学波，罗展，施琳妮，孙心如，张浩，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37