本发明专利技术公开了一种芳樟醇合成酶突变体，所述芳樟醇合成酶突变体包含如下氨基酸突变中的一种或两种组合：E352H或E343D。本发明专利技术还公开了编码所述的芳樟醇合成酶突变体的突变型基因或核酸。本发明专利技术还公开了含有所述的芳樟醇合成酶突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌及其应用。本发明专利技术根据酿酒酵母密码子偏好性合成了薄荷来源的芳樟醇合成酶基因，并建立以竞争性合成途径中番茄红素的颜色指示高通量筛选方法，首次对芳樟醇合成酶进行了定向进化改造，获得了催化活力提高的芳樟醇合成酶突变体，并将筛选到的芳樟醇合成酶突变体应用到酿酒酵母芳樟醇的生产中，为其它单萜的微生物合成提供了方法借鉴。
【技术实现步骤摘要】
芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体及芳樟醇生产工程菌
本专利技术属于酶工程与代谢工程领域，具体涉及一种通过定向进化手段获得催化能力提高的芳樟醇合成酶突变体、编码它的核酸序列、含有该突变体基因的重组表达载体，以及在酿酒酵母中的表达及其应用。
技术介绍
芳樟醇是天然存在于植物中的具有特殊香味的非环状单萜烯醇，不仅具有抗菌、驱避杀虫、消炎止痛以及镇静等多种生物学功效，还可以作为维生素A、维生素E以及异植物醇生产过程中的重要中间体，是食品、医药、化妆品行业的重要原料。目前，市场上的芳樟醇主要来源于植物提取和化学合成两种方法。由于植物生长周期长，且提取工艺复杂，提取的产品纯度低，并不能满足人们对其日益增长的需求。而化学合成的芳樟醇工艺复杂，成本高。随着芳樟醇合成酶的发现，代谢改造微生物生产芳樟醇具有巨大的潜力。国际竹藤中心将来自土肉桂的芳樟醇合成酶定位到酿酒酵母线粒体中，在酿酒酵母的线粒体中完整构建了甲羟戊酸等途径(MVA)利用了在线粒体和细胞质共同参与合成芳樟醇(CN109554403A)。但是芳樟醇合成酶作为芳樟醇合成途径中的关键酶，其在微生物内的表达量和催化活性都比较低，成为限制芳樟醇异源微生物合成的主要瓶颈问题。为了进一步提高芳樟醇异源微生物合成的产量，本专利技术通过定向进化手段对芳樟醇合成酶进行突变，使其具有更高的活性，并在酿酒酵母中进行表达。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种通过定向进化手段获得的芳樟醇合成酶突变体基因和其编码的蛋白，以及其在微生物异源合成芳樟醇中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种芳樟醇合成酶突变体，所述芳樟醇合成酶突变体包含如下氨基酸突变中的一种或两种组合：E352H或E343D。突变体E352H代表第352位由谷氨酸突变成组氨酸，突变体E343D代表第343位谷氨酸突变成天冬氨酸。其中，所述芳樟醇合成酶突变体为E352H和E343D的双突变体，双突变体代表第352位由谷氨酸突变成组氨酸，同时第343位谷氨酸突变成天冬氨酸。本
技术实现思路
还包括编码所述的芳樟醇合成酶的突变型基因或核酸。其中，编码所述芳樟醇合成酶的突变型基因或核酸的第1054位核苷酸由G突变为C、第1056位核苷酸由A突变为C；和/或第1029位核苷酸由A突变为C。其中，所述芳樟醇合成酶的突变型基因序列如序列表中SEQIDNO.2所示，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。其中，序列表中的SEQIDNO.4的氨基酸序列编码的芳樟醇合成酶命名为t67OMcLISE343D/E352H，所述突变体相对于野生型的氨基酸其第343位谷氨酸突变成天冬氨酸、第352位谷氨酸突变成组氨酸。其中，任何对所述SEQIDNO.4所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸、N端氨基端截短、羧基端截短并在氨基酸水平具有至少70％同源性的序列，且具有芳樟醇合成酶活性的，即能催化牻牛儿基焦磷酸(GPP)转化成芳樟醇的，仍属于本专利技术的保护范围。本
技术实现思路
还包括含有所述的芳樟醇合成酶突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌。本专利技术还提供了上述芳樟醇合成酶突变体的获得方法，具体包括：(1)首先通过易错PCR技术建立芳樟醇合成酶基因突变体库。(2)在同一个细胞中，构建番茄红素合成途径和芳樟醇合成途径，由于两者竞争相同的前体物质GPP，因此芳樟醇合成酶的活性与番茄红素积累呈负相关，因此利用菌落颜色变化作为指示对芳樟醇合成酶突变库进行筛选。具有方法如下：将表达芳樟醇合成酶导入到产番茄红素的酿酒酵母菌株YXWP-111(MetabolicEngineering，2015；30：69-78)中，当芳樟醇合成酶活性高时，流向番茄红素合成途径的代谢通量降低，菌株颜色变淡。挑选出颜色变淡得菌株，进行测序，并导入酵母中再验证。具体流程如图2所示。本专利技术进一步涉及包含本专利技术的芳樟醇合成酶突变基因的酿酒酵母重组表达载体。其中，所述重组载体为pUMRI-16-ERG20F96W/N127W-t67OMcLISE343D/E352H。其中，所述重组表达载体通过如下方式构建得到：将SEQIDNO.2所示的芳樟醇合成酶突变体基因t67OMcLISE343D/E352H克隆到酿酒pUMRI-16-ERG20F96W/N127W，得到包含t67OMcLISE343D/E352H基因的酿酒酵母整合型表达质粒pUMRI-16-ERG20F96W/N127W-t67OMcLISE343D/E352H。本专利技术进一步涉及相应的芳樟醇合成工程菌株YLin-05。其中，所述重组菌为酿酒酵母重组菌。本
技术实现思路
还包括所述的重组菌的构建方法，所述重组菌的构建方法包括如下步骤：1)芳樟醇合成酶的突变型基因的获得；2)将步骤1)得到的突变型基因导入PUMRI-16-ERG20F96W/N127W质粒中得到重组质粒；3)将重组质粒整合到酿酒酵母菌株中即得。其中，具体地，所述的生产菌株构建如下：将上述pUMRI-16-ERG20F96W/N127W-t67OMcLISE343D/E352H质粒整合到酿酒酵母BY4741-C-04(NatCommun.2016；7：12851)染色体Ty4位点，使得所述的芳樟醇合成酶基因在酿酒酵母中表达，实现芳樟醇绿色生产。本
技术实现思路
还包括所述的芳樟醇合成酶突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌在合成芳樟醇中的应用。本专利技术还涉及到酿酒酵母芳樟醇合成菌株的两项发酵培养方法。有益效果：本专利技术根据酿酒酵母密码子偏好性合成了薄荷(Menthacitrata)来源的芳樟醇合成酶基因，并建立以竞争性合成途径中番茄红素的颜色指示高通量筛选方法，首次对芳樟醇合成酶进行了定向进化改造，获得了催化活力提高的芳樟醇合成酶突变体，并将筛选到的芳樟醇合成酶突变体应用到酿酒酵母芳樟醇的生产中，为其它单萜的微生物合成提供了方法借鉴。附图说明图1酿酒酵母合成芳樟醇GC-MS鉴定图；图2t67OMcLIS易错PCR产物核酸凝胶电泳图；泳道1DL2000PlusDNAmarker，泳道2和泳道3t67OMcLIS目的基因；图3为芳樟醇合成酶定向进化流程图；A、番茄红素和芳樟醇在代谢途径中的竞争关系B、芳樟醇合成酶的具体定向进化流程；图4用于酿酒酵母芳樟醇合成酶表达的pUMRI-16-ERG20F96W/N127W-t67OMcLISE343D/E352H质粒图谱；图5为芳樟醇合成酶突变体与野生型的活性比较图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。...
【技术保护点】
1.一种芳樟醇合成酶突变体，其特征在于，所述芳樟醇合成酶突变体包含如下氨基酸突变中的一种或两种组合：E352H或E343D。/n
【技术特征摘要】
1.一种芳樟醇合成酶突变体，其特征在于，所述芳樟醇合成酶突变体包含如下氨基酸突变中的一种或两种组合：E352H或E343D。
2.根据权利要求1所述的芳樟醇合成酶突变体，其特征在于，所述芳樟醇合成酶突变体为E352H和E343D的双突变体。
3.编码权利要求1或2所述的芳樟醇合成酶突变体的突变型基因或核酸。
4.根据权利要求3所述的突变型基因或核酸，其特征在于，编码所述芳樟醇合成酶的突变型基因或核酸的第1054位核苷酸由G突变为C、第1056位核苷酸由A突变为C；和/或第1029位核苷酸由A突变为C。
5.根据权利要求4所述的突变型基因或核酸，其特征在于，所述突变型基因或核酸的基因序列如SEQIDNO：2所示。
6.含有权利要求1或2所述的芳樟醇合成酶突变体、权利要求3~5任一...
【专利技术属性】
技术研发人员：周萍萍，杜艺，郑成坤，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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