一种低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶YNLX-HYL及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶YNLX‑HYL及其应用，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。透明质酸裂解酶YNLX‑HYL具有以下性质：最适pH5.5，最适温度35℃，在0℃、10℃和20℃分别具有10％、39％和55％的酶活，在高浓度(NH

【技术实现步骤摘要】
一种低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶YNLX-HYL及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶YNLX-HYL及其应用。
技术介绍
透明质酸又名玻尿酸，是一种天然存在于生物体内的糖胺聚糖。D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，3糖苷键相连构成二糖单元，该二糖单元再以β-1，4糖苷键连接形成的多糖即为透明质酸。透明质酸酶能降解透明质酸。第一类透明质酸酶是透明质酸4-糖基水解酶(EC3.2.1.35)，通过水解1，4-糖苷键来降解透明质酸，以四糖分子为主要产物。第二类透明质酸酶是透明质酸3-糖基水解酶(EC3.2.1.36)，通过水解1，3-糖苷键来降解透明质酸，以四糖和六糖分子为主要产物。第三类透明质酸酶是透明质酸裂解酶(EC4.2.2.1)，通过β-消除机制降解透明质酸，生成不饱和透明质酸二糖(El-Saforyetal.CarbohydratePolymers,2010,81:165–181.)。透明质酸酶可应用于美容、医药、制革等行业中。例如，透明质酸酶可作为药物注射添加剂以增强机体对药物的吸收效率；在眼科手术中，透明质酸酶作为辅助剂可减少麻药的使用量；透明质酸酶可作为药物用于治疗注射透明质酸的美容术后并发症；透明质酸酶可作为加工皮革的酶，改进制革工艺，降低制革过程对环境的污染。低温酶可应用于低温环境要求下的生物
，可防止微生物的污染及减少高温下底物降解导致的副产物，低温反应相对高温反应来说能耗更低(Cavicchiolietal.MicrobialBiotechnology,2011,4(4):449–460.)。盐对酶的性质能产生巨大的影响。在中性盐中，酶会发生盐析作用，导致大部分的酶在高盐浓度下不具有良好的催化活性。盐广泛存在于在自然界和各种生产实践中，包括污水、洗涤、制革、食品、造纸等，例如，在皮革软化过程中，需要添加硫酸钠。具有耐盐性的酶可更好地应用于高盐环境生物
，在高盐环境下反应还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源(Madernetal.Extremophiles,2000,4:91–98)。因此，低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶在制革等行业中具有应用的优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶YNLX-HYL及其应用。本专利技术技术目的具体通过以下技术方案实现：一种低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶YNLX-HYL，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术透明质酸裂解酶YNLX-HYL总共含799个氨基酸，理论分子量为88kDa，其中N端20个氨基酸为预测信号肽序列“MKKTNLAFSLLCLSMGSVHA”。与已实验研究过功能的透明质酸裂解酶进行比对，透明质酸裂解酶YNLX-HYL与Streptococcuspneumoniae来源的透明质酸裂解酶(GenbankID：CTD38391)具有最高的氨基酸序列一致性，仅为30.9％。所述的透明质酸裂解酶YNLX-HYL具有以下性质：最适pH5.5，最适温度35℃，在0℃、10℃和20℃分别具有10％、39％和55％的酶活，在高浓度(NH4)2SO4和Na2SO4中具有良好的活性和稳定性，可裂解透明质酸钠制备不饱和的透明质酸寡糖，不饱和的透明质酸寡糖具有良好的抗氧化性，可清除羟自由基、氮自由基、超氧阴离子自由基以及抗2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)被氧化的能力。所述的低温耐硫酸盐透明质酸裂解酶YNLX-HYL的编码基因ynlx-hyl，所述的编码基因ynlx-hyl的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。其全长2400bp，起始密码为ATG，终止密码为TAG。在本专利技术的另一方面，将本专利技术的透明质酸裂解酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。提供了一种包含所述的透明质酸裂解酶基因ynlx-hyl的重组载体。优选为pEasy-E2-ynlx-hyl。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，将本专利技术的透明质酸裂解酶基因和表达载体pEasy-E2相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-ynlx-hyl。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含所述的透明质酸裂解酶基因ynlx-hyl的重组菌株。优选的所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，更优选的为重组菌株BL21(DE3)/ynlx-hyl。在本专利技术的另一方面，还提供了一种利用透明质酸裂解酶YNLX-HYL制备不饱和透明质酸寡糖的方法。在本专利技术的另一方面，还提供了一种制备透明质酸裂解酶YNLX-HYL的方法，包括以下步骤：1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL表达；3)回收并纯化所表达的透明质酸裂解酶YNLX-HYL。其中，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选的，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/ynlx-hyl。在本专利技术的另一方面，还提供了所述的透明质酸裂解酶YNLX-HYL可用作美容、医药领域用以降解透明质酸的应用，还可用以皮革的制备中。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一个新的透明质酸裂解酶基因，其编码的透明质酸裂解酶YNLX-HYL具有低温耐硫酸盐的特性，YNLX-HYL可裂解透明质酸钠制备不饱和的透明质酸寡糖，不饱和的透明质酸寡糖具有优良的抗氧化性。本专利技术的透明质酸裂解酶可应用于美容、医药、制革等行业。附图说明图1是在大肠杆菌中表达的透明质酸裂解酶YNLX-HYL的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；HYL：纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL；图2是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL的pH活性；图3是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL的pH稳定性；图4是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL的热活性；图5是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL的热稳定性；图6是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL在(NH4)2SO4中的活性；图7是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL在(NH4)2SO4中的稳定性；图8是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL在Na2SO4中的活性；图9是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL在Na2SO4中的稳定性；图10是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL裂解透明质酸钠的产物分析，其中，R：乳糖；4h：反应4h的产物；1h：反应1h的产物；20min：反应20min的产物；图11是纯化的重组透明质酸裂解酶YNLX-HYL裂解透明质酸钠产物的氮自由基清除率，其中，HA：透明质酸钠的氮自由基清除率；HAM：反应1h的产物的氮自由基清除率；HAD：反应5h的产物的氮自由基清除率；图12是纯化的重组透明质酸裂解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶YNLX-HYL，其特征在于，所述的透明质酸裂解酶YNLX-HYL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种低温耐硫酸盐的透明质酸裂解酶YNLX-HYL，其特征在于，所述的透明质酸裂解酶YNLX-HYL的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的透明质酸裂解酶YNLX-HYL的编码基因ynlx-hyl，其特征在于，所述的编码基因ynlx-hyl的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因ynlx-hyl。


4.根据权利要求3所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为pEasy...

【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，黄遵锡，张蕊，雷曦，韩楠玉，唐湘华，吴倩，慕跃林，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53