抗CK19蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，提供了一种抗CK19蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。发明专利技术人还提供了抗CK19蛋白单克隆抗体的制备方法，选取人CK19氨基酸SEQ ID NO.1序列并与KLH偶联，在其羧基端添加了一个半胱氨酸后，作为免疫原。发明专利技术人还提供了一株分泌抗CK19蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系AbM58058‑41A2‑PU，保藏号为：CGMCC NO.17489。抗CK19蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CK19蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

【技术实现步骤摘要】
抗CK19蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及抗CK19蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。
技术介绍
CK19分子量为40kDa，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，主要用于腺癌的诊断。肝细胞不表达CK19，因此可用于肝癌和转移性腺癌的鉴别。CK19在诊断应用主要为1甲状腺滤泡性乳头状癌与滤泡癌的鉴别、2胆管细胞癌与肝细胞癌的鉴别、3脊索瘤与副脊索瘤的鉴别。
技术实现思路
专利技术人提供了一种抗CK19蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CK19蛋白。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.17489的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系AbM58058-41A2-PU，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2019年04月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。进一步地，所述抗CK19蛋白为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。专利技术人还提供了一种抗CK19蛋白单克隆抗体的制备方法，选取CK19蛋白中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列,在其羧基端添加了一个半胱氨酸后，与载体蛋白KLH进行偶联作为免疫原。专利技术人还提供了一株分泌抗CK19蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系AbM58058-41A2-PU，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.17489。专利技术人还提供上述任一所述的抗CK19蛋白单克隆抗体，在CK19蛋白免疫检测中的用途。进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。区别于现有技术，上述技术方案依据CK19蛋白与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的氨基酸序列KAALEDTLAETEARFGAQLAHIQA(SEQIDNo.1)区域作为抗原肽。在其羧基端添加了一个半胱氨酸，并偶联KLH，作为免疫源CK19-KLH。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CK19蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系AbM58058-41A2-PU,以及由该细胞系所分泌的抗CK19蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CK19蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。附图说明图1为AbM58058-41A2-PU杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果。图2为甲状腺乳头状癌样本免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。图3为结肠癌样本免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。图4为胃癌样本1免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。图5为胃癌样本2免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。具体实施方式实施例1免疫原的制备一、免疫原制备一、抗原多肽选择依据Uniprot中登录号为P08727的蛋白质序列进行序列和二级结构分析，全长为400个氨基酸长度的CK19蛋白分子量约为44kDa左右。依据通过在线服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/预测的蛋白的二级结构(secondarystructure)和表面可及性(SurfaceAccessibility)参数，并通过对其抗原性指数(JamesonBA,WolfH.Theantigenicindex:anovelalgorithmforpredictingantigenicdeterminants.ComputApplBiosci.1988,4(1):181-6.)的分析结果，选择靠近C末端的氨基酸序列KAALEDTLAETEARFGAQLAHIQA作为抗原进行化学合成，为便于偶联，在该多肽的羧基端添加了一个半胱氨酸用于提供巯基偶联。二、多肽的偶联及纯化选择ThermoScientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂(ThermoScientific，货号：22582)检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100μLEllman试剂储备液，再加入10μL多肽溶液，用NanoDrop分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200μL去离子水，配制成10mg/mL的KLH溶液，在500μL的ImjectEDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500μL多肽溶液加入到200μL的载体蛋白溶液中，将1mL去离子水加入到一个包装的EDC(10mg)中，缓慢振摇至完全溶解，取50μL加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未偶联的交联剂和盐类，得到CK19-KLH。实施例2AbM58058-41A2-PU杂交瘤细胞系的建立一、免疫将实施例1中CK19-KLH用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，免疫原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。二、细胞融合：无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCCNumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗CK19蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗CK19蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。


3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CK19蛋白。


4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CK19蛋白中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


5.一种抗CK19蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNO.17489的杂交瘤细胞系产生。


6.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：高惠然，杨清海，陈惠玲，周洪辉，王小亚，
申请(专利权)人：福州迈新生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35