一种基于石墨烯多重信号放大SPR传感测定己烯雌酚的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于石墨烯多重信号放大SPR传感测定己烯雌酚的方法，其包括步骤：S1:试样准备：使用磁性石墨烯为吸附剂，对待测样品中的己烯雌酚进行吸附富集，然后洗脱液洗脱，将洗脱下来的己烯雌酚定容，得到待测试样；S2:将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净并连接羧基化氧化石墨烯；S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定DES‑BSA；S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中己烯雌酚的浓度：将含DES的待测试样和DES的单克隆抗体溶液混合进样，共同竞争被固定在SPR芯片表面的DES‑BSA，SPR产生的信号与待测试样中DES的浓度呈反比。本发明专利技术的己烯雌酚含量测定方法，检测限低至2.901x10

【技术实现步骤摘要】
一种基于石墨烯多重信号放大SPR传感测定己烯雌酚的方法
本专利技术涉及一种内分泌干扰的检测
，尤其是一种基于石墨烯多重信号放大SPR传感测定己烯雌酚的方法。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，人们对环境激素也越来越重视，关注食源性激素与人类健康的研究也越来越多。食源性物质中雌激素的含量，对人们身体的健康有很大的影响。尤其是牛奶，牛奶的主要摄入人群是儿童。牛奶中有相当量的雌性激素，有些学者认为，目前消费的牛奶比100年前明显增加。己烯雌酚是雌性激素的一种。据研究，外源性雌激素会使男性的生殖系统发育和功能异常，严重时会引发尿道下裂、性腺萎缩和睾丸癌等严重疾病，而外源性的雌激素也会引起女性的月经不调，卵巢萎缩等疾病，甚至引发不孕和子宫肌瘤等疾病。雌激素残留还会引发女性儿童提前发育、男性儿童乳腺发育呈女性化趋势，由于幼儿身体组织和器官血液分布尚未建立用来阻止或减缓外部污染物的屏障，所以雌激素对幼儿和青少年的毒害性比成人大得多。为了保证下一代的健康，需要对牛奶中己烯雌酚的含量进行控制，因此己烯雌酚是目前牛奶雌性激素的重点检测项目。Spr(SurfacePlasmonResonance)即表面等离子体共振，是一种用于表征表面折射系数改变的光学专业技术。SPR传感检测芯片包括金膜和金膜(或银膜等其他贵金属片)表面的微流通道，在微流通道内且在金膜表面固定着可与目标分子特异性结合的识别分子，金膜下方有棱镜。分析时，当试样从微流通道流过，试样中目标分子与识别分子相互结合，会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过检测SPR角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力等信息。SPR传感测定内分泌干扰具有检测程序简单、无需标记、可实时快速动态检测的优点，且已成为最有希望用于生物痕量检测的技术之一。由于外源性雌激素具有巨大的危害性且能在人体内积累，人们希望对己烯雌酚实现超痕量的检测，而如何进一步降低检测限也是相关研究者的共同目标。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种基于石墨烯多重信号放大SPR传感测定己烯雌酚的方法，通过优化检测程序结合修饰SPR检测芯片，结合采用间接竞争法进一步降低试样中己烯雌酚的检出限、提高检测的灵敏度，实现对试样中己烯雌酚超痕量的检测。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一种基于石墨烯多重信号放大SPR传感测定己烯雌酚的方法，包括如下步骤：S1:试样准备使用磁性石墨烯为吸附剂，对待测样品中的己烯雌酚进行吸附富集、并用洗脱液洗脱，将洗脱下来的己烯雌酚定容，得到待测试样；S2:对SPR芯片进行修饰：将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净，并在贵金属片表面连接羧基化氧化石墨烯；S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定DES-BSA；S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中己烯雌酚的浓度：将含DES的待测试样和DES的单克隆抗体溶液混合进样，共同竞争被固定在SPR芯片表面的DES-BSA，SPR产生的信号与待测试样中DES的浓度呈反比。本专利技术实现检测信号的多重放大：其一为利用磁性石墨烯对待测样品中的己烯雌酚进行富集、经洗脱、定容制得待测试样，待测试样中具有较高浓度的DES；其二为利用石墨烯对SPR芯片的贵金属片表面进行修饰从而可增强SPR信号；其三为，利用石墨烯具有大比表面积及其表面含有丰富羧基的特点，固定更高浓度的DES-BSA，再次有效放大SPR信号。通过以上三重信号放大，可显著提高从待测样品中检出DES的灵敏度，降低其检出限，实现对DES的超痕量检测，LOD值低至2.901x10-6ng/mL。根据本专利技术较佳实施例，步骤S1中，磁性石墨烯按照如下方法制备得到：(1)以纳米石墨烯粉、二价铁铁盐、三价铁铁盐为原料，其中二价铁和三价铁的摩尔比为1:2；(2)向所述原料中加入浓盐酸后，超声脱氧并充分分散于超纯水与无水醇的混合溶剂中，机械搅拌12-24h，加入浓氨水调节pH>10，在加热条件下继续搅拌，得到沉淀物，分离该沉淀物；(3)加入超纯水和无水醇清洗，并采用磁分离器去除无磁性杂质，将所得物分散到无水醇中，低温烘干，即得到磁性石墨烯。根据本专利技术较佳实施例，步骤S1中，所述二价铁盐为硫酸亚铁或氯化亚铁，所述三价铁盐为氯化铁；加入浓氨水调节pH>10后，在70-85℃下搅拌，得到沉淀物，经超纯水和无水醇清洗后，于40-65℃烘干，制得磁性石墨烯材料。根据本专利技术较佳实施例，步骤S1中：采用磁性石墨烯为吸附剂，在pH为酸性条件下对待测样品中的己烯雌酚进行吸附富集，吸附时间为4-10min，采用乙腈为洗脱液，将被磁性石墨烯吸附的己烯雌酚洗脱下来，氮气吹干定容至100-250μL。根据本专利技术较佳实施例，步骤S2中，对SPR芯片进行修饰的方法包括如下步骤：步骤1：清洗SPR芯片的贵金属片，去除其表面的有机物；步骤2：在SPR芯片的贵金属片表面引入带负电荷的基团；步骤3：借助所述带负电荷的基团的静电作用，在所述在SPR芯片的贵金属片表面引入带正电荷的基团；步骤4：借助所述带正电荷的基团的静电作用，在所述在SPR芯片的贵金属片表面连接带负电荷的羧基化氧化石墨烯。根据本专利技术较佳实施例，步骤S2中，所述SPR芯片的贵金属片为金片，具体步骤为：步骤1：采用体积比为H202:H2S04＝1:3配制成piranha溶液，在室温下浸泡SPR芯片的金片，去除金片表面的有机物，用去离子水清洗、无水乙醇清洗，最后氮气吹干；其中H202为质量百分含量30％的双氧水；步骤2：将所述SPR芯片的金片浸泡到MPA(巯基丙酸)的醇溶液中，放置过夜，取出并用乙醇冲洗金片以去除多余的MPA，用去离子水冲洗以去除多余的醇，取出后氮气吹干金片；通过浸泡，MPA与金片形成金硫键并引入带负电荷的羧基；步骤3：将所述SPR芯片的金片浸泡到PAH(聚(烯丙胺·盐酸))溶液中，取出后用去离子水冲洗，氮气吹干金片；通过浸泡和静电作用，使金片表面连接带正电荷的PAH；步骤4：将带有正电荷的金片浸泡在羧基化氧化石墨烯的分散液中，通过浸泡和PAH的静电作用，使羧基化氧化石墨烯连接到金片表面。根据本专利技术较佳实施例，步骤S3中固定DES-BSA的方法为：将SPR芯片及金片装入传感器中，以EDC(1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶液对芯片表面的羧基进行活化5-10min；以pH＝4-5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液，用所述耦合缓冲液配制一定质量浓度的DES-BSA反应15-30min，以乙醇胺为封闭液反应5-20min，以0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生1-3min，依次重复循环1-3次，使DES-BSA与SPR芯片的金片表面带羧基的氧化石墨烯连接，实现DES-BSA的固定化。上述方法，可先配制待用的溶液，再借助相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于石墨烯多重信号放大SPR传感测定己烯雌酚的方法，其特征在于，其包括步骤：/nS1:试样准备/n使用磁性石墨烯为吸附剂，对待测样品中的己烯雌酚进行吸附富集、并用洗脱液洗脱，将洗脱下来的己烯雌酚定容，得到待测试样；/nS2:对SPR芯片进行修饰：将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净，并在贵金属片表面连接羧基化氧化石墨烯；/nS3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定DES-BSA；/nS4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中己烯雌酚的浓度：将含DES的待测试样和DES的单克隆抗体溶液混合进样，共同竞争被固定在SPR芯片表面的DES-BSA，SPR产生的信号与待测试样中DES的浓度呈反比。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于石墨烯多重信号放大SPR传感测定己烯雌酚的方法，其特征在于，其包括步骤：
S1:试样准备
使用磁性石墨烯为吸附剂，对待测样品中的己烯雌酚进行吸附富集、并用洗脱液洗脱，将洗脱下来的己烯雌酚定容，得到待测试样；
S2:对SPR芯片进行修饰：将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净，并在贵金属片表面连接羧基化氧化石墨烯；
S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定DES-BSA；
S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中己烯雌酚的浓度：将含DES的待测试样和DES的单克隆抗体溶液混合进样，共同竞争被固定在SPR芯片表面的DES-BSA，SPR产生的信号与待测试样中DES的浓度呈反比。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，磁性石墨烯按照如下方法制备得到：以纳米石墨烯粉、二价铁铁盐、三价铁铁盐为原料，其中二价铁和三价铁的摩尔比为1:2；向所述原料中加入浓盐酸后，超声脱氧并充分分散于超纯水与无水醇的混合溶剂中，机械搅拌12-24h，加入浓氨水调节pH>10，在加热条件下继续搅拌，得到沉淀物，分离该沉淀物；加入超纯水和无水醇清洗，并采用磁分离器去除无磁性杂质，将所得物分散到无水醇中，低温烘干，即得到磁性石墨烯。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中：采用磁性石墨烯为吸附剂，在pH为酸性条件下对待测样品中的己烯雌酚进行吸附富集，吸附时间为4-10min，采用乙腈为洗脱液，将被磁性石墨烯吸附的己烯雌酚洗脱下来，氮气吹干定容至100-250μL。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，对SPR芯片进行修饰的方法包括如下步骤：
步骤1：清洗SPR芯片的贵金属片，去除其表面的有机物；
步骤2：在SPR芯片的贵金属片表面引入带负电荷的基团；
步骤3：借助所述带负电荷的基团的静电作用，在所述在SPR芯片的贵金属片表面引入带正电荷的基团；
步骤4：借助所述带正电荷的基团的静电作用，在所述在SPR芯片的贵金属片表面连接带负电荷的羧基化氧化石墨烯。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，步骤S2中，所述SPR芯片的贵金属片为金片，具体步骤为：
步骤1：采用体积比为H202:H2S04＝1:3配制成piranha溶液，在室温下浸泡SPR芯片的金片，去除金片表面的有机物，用去离子水清洗、无水乙醇清洗，最后氮气吹干；其中H2...

【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，李双，白家磊，彭媛，宁保安，王江，韩殿鹏，任汉林，周焕英，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12