一种锌指蛋白基因、合成方法及用途技术

本发明专利技术属于分子生物学基因技术领域，公开了一种锌指蛋白基因、合成方法及用途，锌指蛋白BnBBX22基因在耐盐甘蓝型油菜2205和敏盐甘蓝型油菜1423中，基因序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。根据甘蓝型油菜BnaA07g34250D基因的编码区CDS序列设计特异性引物，利用TA克隆的方法，在耐盐甘蓝型油菜2205和敏盐甘蓝型油菜1423中克隆到该基因序列。利用本发明专利技术的基因，可通过转基因及基因编辑等遗传转化技术研究其对甘蓝型油菜耐盐性的影响。同时，结合育种技术为创建甘蓝型油菜耐盐新品种奠定理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种锌指蛋白基因、合成方法及用途
本专利技术属于分子生物学基因
，尤其涉及一种锌指蛋白基因、合成方法及用途。
技术介绍
植物在整个生长周期中，周围的环境是不断变化的，对其生长有很大的影响。土壤盐渍化是影响作物生长及产量的重要非生物胁迫之一，抑制植物组织和器官的生长和分化，使植物的发育进程提前，造成植物的减产或死亡。随着我国人口的急剧增加及工业的高速发展，可耕地急剧下降，而不合理耕作、灌溉等又造成大量良田次生盐渍化，从而导致我国耕地逐年急剧下降，严重威胁着我国粮食生产。盐渍土对农业直接危害表现为限制了农业对土地资源的利用，降低了农业生产能力。随着分子生物学技术的发展，使人们从分子水平研究植物与非生物胁迫的关系成为了可能，并为改良作物的抗逆性提供了新的途径。研究植物与非生物胁迫的关系，抗逆相关信号转导途径及机制，克隆抗逆相关的基因为培育抗逆作物品种具有重要的指导意义。油菜是我国继水稻、小麦、玉米、大豆之后的第5大作物，并成为我国的优势优良作物，其中甘蓝型油菜是三种油用油菜(白菜型油菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜)中籽粒产量最高的种类，是我国重要的油料作物。但我国植物油的自给率约40％，远远低于60％的安全水平。并且近年来油菜种植主产区湖北、安徽、湖南、江苏的油菜播种面积明显下降，而油菜在黄淮海地区具有较大的种植面积，且该区域具有较多的闲置盐碱土地。在油料生产满足不了需求增长的严重压力下，如何充分利用盐碱地扩大油菜种植面积、增加油菜籽总产量，是油菜生产迫切需要解决的重大课题。因此，进一步加强甘蓝型油菜理论研究对实际生产应用具有重要的意义。植物在对抗逆境胁迫过程中会有两种蛋白参与，功能蛋白和调节蛋白，其中转录因子就是一类重要的调节蛋白。转录因子，是能够与真核生物启动子顺式作用元件或其它转录因子的功能区域相互作用，激活或抑制基因表达的一类蛋白分子。在植物中锌指蛋白类转录因子作用广泛，在诸多发育过程中均有涉及，例如，调节植物的生长、代谢过程、生物(非生物)胁迫和信号响应等。目前已发现，拟南芥C2H2型锌指蛋白受非生物胁迫诱导表达，bZIP转录因子能够对盐胁迫和ABA处理产生反应，被认为在ABA诱导的基因调节中起作用。在拟南芥中过量表达STZ，转基因拟南芥的生长会被阻碍并且具有抗旱性。BBX22基因在拟南芥中已分离克隆出来，并证明其在光形态建成中起着一定作用，但其是否能提高植物耐盐性并没有研究报道。在油菜中，对于锌指蛋白类的转录因子功能研究还很少，BBX22基因在甘蓝型油菜中也未见有克隆的报道。因此，发现新的抗性基因，研究植物对盐胁迫抗性机制具有深远的意义。现有技术以甘蓝型油菜耐盐品系2205与敏盐品系1423的F2:3群体，构建了覆盖甘蓝型油菜的19个连锁群的遗传图谱。在此基础上，对该图谱进行了加密，在A07染色体上定位到一个与叶绿素含量相关的主效QTL(qSPAD5)，进一步精细定位，将该QTL的区间缩小到白菜A07染色体上的390kb范围之内。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：在油菜中，对于锌指蛋白类的转录因子功能研究很少，BBX22基因在甘蓝型油菜中也未见有克隆的报道。油菜的研究一开始大多是采用正向遗传学的方法，比如通过QTL定位，耗时长，所以至今油菜中已报道的耐盐基因也不多。本研究发现的该基因在同源拟南芥中的功能与光形态建成有关，并没有报道与耐盐有关，这也是发现本基因的一个新功能。转录因子家族一般都有相似的功能，据此与该基因同一个亚组的基因或许也有该功能，这为挖掘更多的耐盐基因，培育耐盐新品种提供了另一种方向及思路。油菜耐盐基因研究少，这对油菜耐盐品种的培育产生了一定的影响。解决以上问题及缺陷的难度为：甘蓝型油菜为多倍体，一个基因有多个拷贝，研究这些拷贝是否有功能冗余或发挥不同的功能，工作量会大大增加。另外，得到转基因油菜工作量大且耗时长。解决以上问题及缺陷的意义为：挖掘了更多的耐盐基因，为研究植物对盐胁迫抗性机制具有深远的意义，为培育耐盐新品种提供了另一种方向及思路。同时，对进一步加强甘蓝型油菜理论研究对实际生产的应用具有重要的指导意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种锌指蛋白基因、合成方法及用途。本专利技术是这样实现的，一种锌指蛋白基因，为锌指蛋白BnBBX22基因，在耐盐甘蓝型油菜2205和敏盐甘蓝型油菜1423中，基因序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。进一步，所述锌指蛋白BnBBX22基因在耐盐甘蓝型油菜2205和敏盐甘蓝型油菜1423中的编码区全长分别为873bp和867bp。本专利技术的另一目的在于提供一种表达所述锌指蛋白基因的蛋白质，表达SEQIDNO：1的蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNO：3和表达SEQIDNO：2的氨基酸序列为SEQIDNO：4。本专利技术的另一目的在于提供一种所述锌指蛋白基因的合成方法，所述锌指蛋白基因的合成方法包括：第一步，甘蓝型油菜幼苗根组织总RNA提取及第一链cDNA合成；第二步，根据甘蓝型油菜BnaA07g34250D基因在甘蓝型油菜数据库中查询该基因序列，设计基因特异引物，以cDNA为模板，PCR扩增出BnBBX22基因片段；第三步，将片段回收后克隆到T载体上，测序后获得C2H2型锌指蛋白BnBBX22基因序列。进一步，所述第一步包括：甘蓝型油菜组织总RNA提取及cDNA合成，将油菜种子种于营养土中，在温度25/22℃，湿度60％，光照强度200umol.m-2.s-1，光照时间每天10h条件下的光照培养箱中培养；当幼苗长到三叶期时，选取生长情况一致的幼苗提取根组织总RNA，并反转录成cDNA。进一步，所述第二步耐盐甘蓝型油菜2205的引物序列为：BBX22-1F：ATGAAGATTCAGTGTAACGTGTGCGAGGCGBBX22-1R：TTAGAATCGTCGCCGCCGTTTCCCAAT敏盐甘蓝型油菜1423的引物序列：BBX22-2F：ATGAAGATTCAGTGTAACGTCTGCGAGABBX22-2R：TTAGAACCGTCTTCGCTTCCCAACCCTCT。进一步，所述第三步包括：甘蓝型油菜BnaA07g34250D基因克隆，以cDNA为模板，采用高保真酶进行PCR扩增，将扩增的片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，克隆于pMD19-T载体，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆测序。本专利技术的另一目的在于提供一种所述锌指蛋白BnBBX22基因在培育耐盐甘蓝型油菜品种中的用途，利用转基因或基因编辑手段，调控所述基因序列的表达水平，引起甘蓝型油菜耐盐调控机制的变化，获得耐盐性不同的甘蓝型油菜品种。结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：本专利技术在此区间内，提供了一个甘蓝型油菜耐盐相关的C2H2型锌指蛋白BnBBX22基因，在耐盐与敏盐甘蓝型油菜中克隆了该基因并比较了结构差异，不仅有助于对油菜耐盐机理的了解，同时为培育油菜耐盐新品种提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种锌指蛋白基因，其特征在于，所述锌指蛋白基因的核苷酸序列分别为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2。/n

【技术特征摘要】
1.一种锌指蛋白基因，其特征在于，所述锌指蛋白基因的核苷酸序列分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。


2.如权利要求1所述的锌指蛋白基因，其特征在于，所述SEQIDNO：1编码区全长为873bp，所述SEQIDNO：2编码区全长为867bp。


3.一种表达权利要求1～2任意一项所述锌指蛋白基因的蛋白质，其特征在于，表达所述SEQIDNO：1的氨基酸序列为SEQIDNO：3，表达所述SEQIDNO：2的氨基酸序列为SEQIDNO：4。


4.一种如权利要求1～2任意一项所述锌指蛋白基因的合成方法，其特征在于，所述锌指蛋白基因的合成方法包括：
第一步，甘蓝型油菜幼苗根组织总RNA提取及第一链cDNA合成；
第二步，根据甘蓝型油菜BnaA07g34250D基因在甘蓝型油菜数据库中查询该基因序列，设计基因特异引物，以cDNA为模板，PCR扩增出基因片段；
第三步，将片段回收后克隆到T载体上，测序后获得C2H2型锌指蛋白基因序列。


5.如权利要求4所述的锌指蛋白基因的合成方法，其特征在于，所述第一步包括：甘蓝型油菜组织总RNA提取及cDNA合成，将油菜种子种于营养土中，在温度25/22℃，湿度60％，光照强度200umol.m-2.s-1，光照时...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄镇，张燕，郎丽娜，徐爱遐，陶顺仙，李萍，张琪，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61