本发明专利技术公开了黄瓜NPF7.2基因，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还公开了黄瓜NPF7.2基因编码的蛋白，其序列如SEQ ID No.2所示。黄瓜NPF7.2全长1806bp，编码601个氨基酸1，其蛋白质分子质量为66.6kD，理论等电点为7.5，为稳定蛋白，含有12个跨膜螺旋区，第6个和第7个跨膜结构域之间存在一个大个亲水环，且该蛋白为亲水性蛋白。本发明专利技术还公开了上述黄瓜NPF7.2基因的时空表达。通过实时荧光定量得出其主要在根中和花中表达，表明NPF7.2可能不仅参与硝酸盐的转运，也可能是感受硝酸盐的信号受体。
【技术实现步骤摘要】
黄瓜硝酸盐转运蛋白NPF7.2基因、蛋白及表达方法
本专利技术涉及黄瓜NPF7.2基因、蛋白及基因表达方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
氮(N)是生命的基本元素之一，是构成叶绿素、蛋白质等物质的重要组分，对维持生物体的生命活动有重要意义，同时也是限制作物产量的关键元素。和其他元素不同，它不能从岩石种中释放到土壤中，在农业系统中，作物的高产依赖于大量氮肥的施用。但是有研究表明，从上世纪中叶以来，中国的氮肥的施用虽然在增加，利用率却从60％下降到2008年的28.3％，最近十年虽然在缓慢提升氮肥利用效率，但目前也仅达到30％左右，低于世界平均水平(ERSMANJW.etal，2008)。氮肥的大量施用不仅造成了严重的经济损失，还带来了一系列严重的环境问题，例如：水土富营养化，土壤酸化，臭氧层的空洞等。黄瓜[(CucumissativusL)]是我国重要的栽培蔬菜作物之一，黄瓜喜水喜肥，对肥料尤其是氮肥的需求量大，氮肥的过量施用也引起了黄瓜果实品质和食用安全的降低。因此，提高氮肥的利用率，减少氮肥的施用量，保证作物产量，具有重要的理论和现实意义。为适应环境硝态氮供应浓度的时空变化，植物进化出了一系列的基因，按基因家族分类，主要有以下四个基因家族：硝酸盐、肽转运蛋白家族NPF家族(又名NRT1家族)，硝酸盐相关转运蛋白2家族NRT2家族、氯通道家族(LCA/H)和慢阴离子通道家族(SLAC/SLAH)来转运硝酸盐。硝态氮及多肽转运蛋白(NPFs，又称为NRT:硝态氮转运蛋白)家族庞大，在拟南芥和水稻中分别由53和93个NPF基因(HuangNCet.al.1996)。在拟南芥中的研究表明，硝酸盐转运蛋白NPF7.2主要负责硝态氮的运输同时缓解镉胁迫(LiJY.etal,2010)。关于氮利用效率的研究主要集中在模式植物拟南芥和水稻上。对于园艺植物黄瓜而言，氮利用效率的研究虽然较多，但大部分集中于生理方面，在分子层面的研究较少，虽然黄瓜NRT2.1基因前人已有报道，但是黄瓜中NPF家族的报道较少。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供黄瓜NPF7.2基因序列、蛋白结构及基因表达方法。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种黄瓜NPF7.2基因，其序列如SEQIDNo.1所示。进一步的，黄瓜NPF7.2基因序列全长为1806bp，编码601个氨基酸，其蛋白分子质量为66.6kD，理论等电点为7.5，负电荷氨基酸残基数为50个，正电荷残基数为51，不稳定系数为27.98，为稳定蛋白，脂肪系数96.04，总平均亲水性0.23。黄瓜NPF7.2基因编码的蛋白，其序列如SEQIDNo.2所示。进一步的，所述蛋白的跨膜螺旋区位置分别在SEQIDNo.2的1-47，71-82，106-114，138-157，181-199，223-228，252-352，376-387，411-429，453-510，534-558，582-601。本专利技术还公开了上述黄瓜NPF7.2基因的表达方法，其步骤为：(1)合成黄瓜NPF7.2基因的引物序列NPF7.2F和NPF7.2R，分别如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示；(2)使用实时荧光定量PCR法扩增出黄瓜NPF7.2基因序列全长，反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳回收；(3)回收产物连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α。进一步的，实时荧光定量PCR反应体系为20μl，其中2×Taq10μl，NPF7.2F0.5μl，NPF7.2R0.5μl，模板1μl，ddH2O8μl；PCR反应条件为：95℃3min，95℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min。进一步的，所述黄瓜NPF7.2基因主要在根与花中表达。附图说明本专利技术有如下附图：图1为黄瓜NPF7.2基因PCR扩增电泳图。图2为黄瓜NPF7.2基因的时空表达。图3为黄瓜NPF7.2蛋白跨膜结构模式图。具体实施方式以下结合附图1-3对本专利技术作进一步详细说明。实施例1黄瓜NPF7.2基因表达方法，其步骤包括：(1)合成黄瓜NPF7.2基因的引物序列NPF7.2F和NPF7.2R，其中NPF7.2F的序列如SEQIDNo.3所示，NPF7.2R的序列如SEQIDNo.4所示，(2)使用实时定量PCR法扩增出黄瓜NPF7.2基因序列全长，反应体系为20μl，其中2×Taq10μl，NPF7.2F0.5μl，NPF7.2R0.5μl，模板1μl，ddH2O8μl；PCR反应条件为：95℃3min，95℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳回收，PCR扩增电泳图见图1；(3)回收产物连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α。实施例2分别提取黄瓜根茎叶花果的RNA反转录为cDNA后进行荧光定量PCR分析；一、RNA的提取RNA提取采用华越洋试剂盒，具体提取步骤如下：(1)向2ml离心管装有的样品中加入1000μl细胞裂解液A，然后用电动组织研磨器研磨30s。(2)在离心管中加入300μl的去蛋白液和200μl的氯仿溶液，在震荡器上震荡30s混匀。(3)室温12000rpm离心5-10min，两相间将约有5-10mm厚的细胞破碎物。将上清液(不超过700μl)转移至另一个干净的1.5ml的离心管中。(4)加入等体积的漂洗液C，充分颠倒混匀。再将所得的混合物分两次加入同一个离心吸附柱中，每次加入后都12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。(5)向吸附柱中加500μl的洗注液D，12000rpm室温离心1min，倒掉废液，重复一遍此操作。(6)RNA洗脱：将离心吸附柱转移到RNase-Free1.5ml离心收集管中，在管中央加入30μlRNA洗脱液F，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，离心管中溶液即为RNA。二、cDNA的合成取获得的RNA，在冰上解冻，取经DEPC处理过的0.1ml离心管，冰上加入以下试剂：反转录程序为第一阶段42℃反应15min，第二阶段95℃反应3min，后于冰上终止合成反应，产物于-20℃保存。三、荧光定量PCR分析荧光定量PCR以TUb为内参基因，荧光定量PCR反应体系如下表结果如图2所示，结果表明其主要在根与花中表达。实施例3使用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对黄瓜CsNPF7.2所编码的氨基酸序列进行亲水性分析，见图3，结果表明具有12个假定的跨膜结构域，其中第6和第7个结构域中间差距较大，符合NPF家族成员的拓扑结构。本说明书中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种黄瓜NPF7.2基因，其序列如SEQ ID No.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种黄瓜NPF7.2基因，其序列如SEQIDNo.1所示。
2.如权利要求1所述的黄瓜NPF7.2基因，其特征在于，黄瓜NPF7.2基因序列全长为1806bp。
3.如权利要求1所述的黄瓜NPF7.2基因编码的蛋白，其序列如SEQIDNo.2所示。
4.如权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白所对应的氨基酸数目为601个，分子量为66594.04，理论等电点为7.5，负电荷氨基酸残基数为50个，正电荷残基数为51，不稳定系数为27.98，为稳定蛋白，脂肪系数96.04，总平均亲水性0.23。
5.如权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的跨膜螺旋区位置分别在SEQIDNo.2的1-47，71-82，106-114，138-157，181-199，223-228，252-352，376-387，411-429，453-510，534-558，582-601。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：张文娜，张嘉丽，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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