水稻粒宽和粒重基因GW5．1的克隆与应用制造技术

本发明专利技术属于植物功能基因组和基因工程技术领域，具体涉及水稻粒宽和粒重基因

【技术实现步骤摘要】
水稻粒宽和粒重基因GW5．1的克隆与应用
本专利技术涉及植物功能基因组和基因工程
具体涉及到一个位于水稻第5染色体着丝粒附近控制粒宽和粒重的主效QTL基因GW5.1的克隆与应用。
技术介绍
水稻是全球主要粮食作物，对其产量和品质的遗传改良，具有重要意义。(1)粒形由粒长、粒宽和粒厚构成，通过决定千粒重而影响水稻的谷粒产量。适当增加种子大小，是实现稻米增产和稳产的一条重要途径。(2)粒形是稻米外观品质的一个重要性状，不同的消费者对细长型和短圆型的大米有迥异的偏好性；同时，粒形可影响糙米率和整精米率等加工碾磨品质。(3)粒形是水稻驯化的重要靶标性状，粒形基因的鉴定和克隆可以为禾本科的进化研究提供线索(Tan等，2000，Theor.Appl.Genet.101:823-829；Huang等，2013，TrendsPlantSci18:28-226；Shomura等，2008，NatGenet40:1023–1028)。粒形性状属于典型的数量性状，对其控制基因的克隆存在相当的难度。一般的常规策略是，利用分子标记技术对初级作图遗传群体中控制粒形的QTL(QuantitativeTraitLoci)进行初步定位和遗传效应分析，进而通过构建高级作图群体(如染色体片段代换系、近等基因系等)，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子来进行精细定位和克隆(方宣钧等，2000)。借助这种策略，分子遗传学家们已经克隆了一系列水稻粒形QTL基因(FanandLi,2019，Mol.Breeding39:163–187；Li等，2019，AnnuRevPlantBiol70:435–463；ZuoandLi,2014,AnnuRevGenet48:99–118)，这些基因编码的蛋白主要涉及到：(1)植物生长发育相关的信号物质的生物合成、稳态调节和信号转导：G蛋白信号途径、激素(BR、IAA和CK)途径，多肽信号途径和MAPK信号途径。(2)蛋白水平的调控，主要是蛋白的泛素化修饰介导的蛋白降解途径和蛋白磷酸化修饰介导的相关信号分子的激活/失活。(3)转录水平的调控：包括转录因子的调控和表观调控(miRNA降解靶基因mRNA、DNA修饰和组蛋白修饰)。然而，这些已克隆的粒形基因对揭示粒形遗传和生化调控机制来说，仍然是零散化和碎片化的。因此，迫切需要克隆更多的粒形基因，以全面解析粒形形成的分子机制。在此背景下，QTL-Seq和QTG-seq等QTL基因克隆方法被开发出来(Takagi等，2013,PlantJ.74:174–183；Zhang等，2019，Mol.Plant12:426–437)，但仍不能满足快速和大批量鉴定克隆QTL基因的需要。申请人开发了RapMap技术，集成了BSA(BulkedSegregantAnalysis)和芯片技术/二代测序技术的优点，并引入共分离标准的图位克隆新方法，大大加快了QTL基因克隆的效率，为快速大批量克隆自然变异调控基因提供了可能。本专利技术利用RapMap的方法分离克隆一个控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因GW5.1，为水稻产量和品质的遗传改良提供新的基因资源，也为作物的进化研究提供新的线索。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了水稻GW5.1基因及其等位基因在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用；所述的GW5.1基因的NCBIaccession为LOC4338398。本专利技术的另一个目的在于提供了SEQIDNO.3所示氨基酸序列或是编码SEQIDNO.3所示序列的核苷酸序列在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用。本专利技术的最后一个目的在于提供了一段分离自Iksan438的基因序列，所述序列为SEQIDNO.1所示，其CDS序列为SEQIDNO.2所示。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：本专利技术以宽粒品种ZS97和窄粒品种Iksan438为双亲得到F2随机小群体(图1)，将极端表型单株按BSA方法混合建池后，进行RICE6K育种芯片分析，最终发现了一个新的QTL，命名为GW5.1。根据当代的重组单株以及筛选后代大群体得到的重组单株及其后代测验结果，我们将GW5.1精细定位在28kb的染色体区段。根据RAP-DB数据库网站注释，该区段有两个候选基因ORF1和ORF2。其中ORF2基因在幼穗时期几乎不表达，而珍汕97的ORF1基因与Iksan438相比，在第2外显子上有一个11.8kb反转录转座子插入，导致基因功能缺失。因此，我们将ORF1初步确定为GW5.1候选基因，通过进一步的敲除和过表达实验，最终确定，该基因是一个负调控水稻粒宽的主效基因。在水稻Iksan438中该基因的序列为SEQIDNO.1所示，CDS序列为SEQIDNO.2所示，编码蛋白质序列为SEQIDNO.3所示。SEQIDNO.3所示氨基酸序列或是编码SEQIDNO.3所示序列的核苷酸序列在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用，包括利用本领域的常规方式，将窄粒水稻中的该基因敲除，可获得粒宽更宽的水稻；或是在宽粒水稻中超表达该基因，可获得粒宽更窄的水稻。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术在水稻中克隆了一个对粒宽和粒重具有很大负调控效应的基因GW5.1，其功能缺失的等位基因可以增加水稻谷粒粒宽和粒重，为水稻的产量和品质育种提供新的基因资源，也为作物的进化研究提供线索。附图说明图1为GW5.1基因克隆的技术路线示意图。图2.本专利技术克隆的GW5.1的比较测序示意图和11.8kb反转录转座子插入在DNA和mRNA水平的验证。图3.是本专利技术CRISPR敲除转基因和互补转基因粒宽表型分析示意图；其中：ZH11为中花11；CR4-4，CR4-8和CR9-3为中花11敲除了GW5.1基因的阳性株；AA是珍汕97背景的近等基因系；Com.是complementation代表互补转基因阳性单株。图4是本专利技术在阳性敲除转基因单株中，有三株独立阳性单株不同类型的纯合移码突变体的核苷酸序列。图5本专利技术中的部分CRISPR敲除T0代转基因阳性、阴性单株的粒宽表型图；其中，CR(+)表示CRISPR敲除T0代转基因阳性株，CR(-)表示CRISPR敲除T0代转基因阴性株。图6本专利技术中的GW5.1近等基因系的粒宽和千粒重统计。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：GW5.1的初定位1.GW5.1定位遗传群体构建及两个极端粒宽表型混池的芯片检测初定位流程如附图1所示，用珍汕97与Iksan438杂交，得到F1，再自交产生F2随机群体。对F2群体各个单株粒宽表型进行考察，每个单株选取有代表性的饱满的10粒种子，按照同样的方向肩并肩依次排列，不重叠且不留缝隙的紧靠在一起，用游标卡尺读取十粒宽数据，进行3次重复后取其平均值。根据得到的粒宽表型频数分布图，构建极端高低混池，极端池里每株随机选择1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的水稻基因及其等位基因在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用；所述的基因NCBI accession为LOC4338398。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的水稻基因及其等位基因在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用；所述的基因NCBIaccession为LOC4338398。


2.SEQIDNO.3所示氨基酸序列或是编码SEQIDNO.3所示序列的核苷酸序列在控制水稻粒宽和/或粒重...

【专利技术属性】
技术研发人员：李一博，樊亚伟，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42