一种里氏木霉及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程和微生物改造技术领域，具体提供了一种高产脂肪酶的里氏木霉突变菌株及其应用。所述突变菌的保藏编号为CCTCC NO:M2018880。所述突变菌株能高效表达脂肪酶，摇瓶发酵酶活高达2140 U/mL，比出发菌提高的54%，20L罐发酵酶活高达40000 U/mL，比出发菌株提高了48%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于脂肪酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进其推广与应用。

【技术实现步骤摘要】
一种里氏木霉及其应用
本专利技术属于基因工程和微生物改造
，具体涉及一种里氏木霉突变菌株及其应用。
技术介绍
脂肪酶又称甘油酯水解酶，能够催化天然底物油脂的分解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，其天然底物是生物产生的天然油脂，是最早被研究的酶类之一，作用于异相系统，即在油水界面上水解脂肪酸甘油酯，而只有当底物以微粒、小聚合分散状态或成乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。脂肪酶被广泛应用于食品、生物、饲料等领域，在许多方面已显示出不可估量的开发潜力。脂肪参与动物机体的组成，是动物必需的营养物质，是畜禽体内主要能量物质，是机体最大的能量储备库，当机体需要能量时，体内脂肪在脂肪酶的作用下被分解，参与能量代谢，保证其健康生长，并可满足畜禽特殊生长阶段对高能量的需求。另外，在动物饲料中添加脂肪可以改善饲料外观油性，减少饲料加工过程中的粉尘污染，同时可增加动物的食欲及其对脂溶性物质的吸收。动物饲料中的脂类必须经脂肪酶分解成脂肪酸、甘油二脂、甘油单酯后，才能被畜禽机体消化、吸收和利用，在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程。大量研究表明，微生物脂肪酶对动物体内源消化酶的分泌有一定的促进作用，并有利于营养物质的消化与吸收。此外，在饲料中添加外源脂肪酶能够补充动物特殊生理阶段内源脂肪酶的不足，提高脂肪的消化，提高断奶仔猪等幼龄动物的生产性能、缓解应激、促进动物生长。脂肪酶的生产方法有三种，即化学合成法（通过分析酶的氨基酸组成顺序，然后用化学方法合成）、提取法（从动植物器官或组织中提取）、生物发酵法（利用微生物发酵获得）。化学合成法和提取法因试验技术等客观条件而受到限制，微生物脂肪酶种类多，微生物发酵法成为脂肪酶主要生产方法，由于微生物资源丰富，并且种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH和作用温度范围，且微生物来源的脂肪酶一般均是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，生产不受自然环境的影响，可通过人工控制来大量生产目的酶，此外，其生产周期短，生产成本低，是一种经济而实用的方法，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。脂肪酶在微生物中具有广泛的分布，已知大约有2%的微生物产脂肪酶，其产生菌包括细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属，至少65个属的微生物产脂肪酶。近年来，微生物脂肪酶的研究主要集中在高产菌株的选育、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺优化、酶的分离纯化及工业化生产；提高脂肪酶酶活性的方法有诱变育种、构建基因工程菌及优化发酵工艺等。但目前现有的脂肪酶生产菌株的产量仍偏低，脂肪酶的生产成本需要进一步降低，才能有效促进该酶的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种高产脂肪酶的里氏木霉突变菌株。申请人首先将来源于疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyceslanuginosus）的脂肪酶基因转化入里氏木霉（Trichodermareesei）宿主细胞中，构建得到重组表达该脂肪酶的工程菌。然后以该工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法筛选获得脂肪酶产量得到显著提高的里氏木霉突变菌株，能有效降低脂肪酶的生产成本，促进该酶的广泛应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术一方面提供了一种里氏木霉工程菌，其携带有表达脂肪酶基因的重组载体。所述的脂肪酶，其编码氨基酸序列为SEQIDNO:2。本专利技术一方面提供了一种突变菌株里氏木霉C2TL1（TrichodermareeseiC2TL1），已于2018年12月10日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCCNO:M2018880。本专利技术还提供了所述里氏木霉突变株在生产脂肪酶中的应用。本专利技术所述突变菌株里氏木霉C2TL1摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活达2140U/ml，比出发菌提高了54%；20L罐发酵上清液中脂肪酶酶活高达40000U/ml，比出发菌株提高了48％，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌里氏木霉C2TL1发酵上清液的最适作用pH为8.0，最适作用温度为55℃，与出发菌一致。本专利技术提供的里氏木霉突变菌株可广泛应用于脂肪酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进脂肪酶的推广与应用。附图说明图1为本专利技术重组表达的脂肪酶的pH-相对酶活曲线；图2为本专利技术重组表达的脂肪酶的温度-相对酶活曲线。具体实施方式本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本专利技术不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。下面结合具体的实施方式对本专利技术进行详细描述。实施例1疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因表达载体的构建1.1提取疏绵状嗜热丝孢菌总基因组DNA将疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyceslanuginosus）接种摇瓶培养基过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mMTrisHCl,100mMEDTA,250mMNaCl,1%SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠、在珠打仪剧烈振荡2min左右；水浴锅65℃水浴20min后加入200μl10MNH4AC冰浴10min；13000rpm离心10min取上清，然后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min弃上清，用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入适量水溶解于-20℃保存。基因克隆设计引物：TG-F：AAAGGTACCATGAGGAGCTCCCTTGTGC；T1-F：CTCTACTCGTTTGAAGGGTAAGTGTCGACATAAG；T1-R：CTTATGTCGACACTTACCCTTCAAACGAGTAGAG；T2-F：GGATCGGGAATCTTAAGTTCCTCATGAAAGAAATAAATG；T2-R：CATTTATTTCTTTCATGAGGAACTTAAGATTCCCGATCC；T3-F：CACCGGCGGCAATAACCGGCCTAACATTCCGGAT；T3-R：ATCCGGAATGTTAGGCCGGTTATTGCCGCCGGTG；TG-R:AAAACGCGTCTAAAGACATGTCCCAATTAAC。以1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用引物TG-F和T1-R，T1-F和T2-R，T2-F和T3-R，T3-F和TG-R进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S，59℃40S，72℃50s30个循环；72℃7min本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的里氏木霉工程菌株携带有用于重组表达脂肪酶的重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的里氏木霉工程菌株携带有用于重组表达脂肪酶的重组质粒。


2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的脂肪酶的编码氨基酸序列为SEQIDNO:2。


3.一种里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述的里氏木霉突变菌株的保藏编号...

【专利技术属性】
技术研发人员：张青，田延军，许韡，刘艳萍，李瑞，宋清清，陈艳超，徐晓东，张金祥，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37