一株高效生产苹果酸的黑曲霉菌株、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一株高效生产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，所述黑曲霉基因工程菌株是敲除了柠檬酸转运蛋白基因cexA，并过表达了黑曲霉来源的葡萄糖转运蛋白基因mstC、己糖激酶基因hxkA、磷酸果糖激酶基因pfkA和丙酮酸激酶基因pkiA的黑曲霉基因工程菌株。本发明专利技术黑曲霉基因工程菌株生产苹果酸的效率显著提高，经发酵罐分批补料发酵第八天的产量达到195.72～210g/L，苹果酸对葡萄糖的转化率达到1.59～1.64mol/mol，发酵周期较出发菌株缩短一天，由原来的9天缩短至8天。为微生物发酵法制备苹果酸提供了优良菌种。

A high efficient production of malic acid by Aspergillus niger strain, construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一株高效生产苹果酸的黑曲霉菌株、构建方法及应用
本专利技术属于微生物
，尤其是一株高效生产苹果酸的黑曲霉菌株、构建方法及应用。
技术介绍
黑曲霉作为重要的细胞工厂用于有机酸的发酵生产已有100多年的历史，不仅是GRAS(generallyregardedsafe)菌株，而且能够利用廉价的碳源。L-苹果酸，又名2-羟基丁二酸，主要用于食品、医药等行业。在食品行业，L-苹果酸主要用作食品酸味剂，与柠檬酸相比，具有味道柔和、酸度大，滞留时间长等特点，且不损害口腔牙齿、不积累脂肪，成为一种低热量的国际食品界公认的安全性食品酸味剂，是目前世界食品行业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。在医药行业，L-苹果酸被用于治疗肝病、贫血、尿毒症等多种疾病。而且由于L-苹果酸在代谢上利于氨基酸的吸收，常被配入复合氨基酸注射液中。由于L-苹果酸酸味刺激效果优于柠檬酸，而且因西方发达国家消费者对化学合成产品持谨慎和怀疑态度，因此发酵生产的天然产品L-苹果酸在食品和医药领域应用范围在扩大，并且美国FDA禁止在食品中使用DL-苹果酸，又限制了柠檬酸在儿童、老年食品中的应用，所以近几年来L-苹果酸在食品工业的应用已逐渐取代柠檬酸，因此，国际市场上对L-苹果酸的需求量与日俱增。当前，应用黑曲霉发酵生产苹果酸存在生产效率低，发酵生产周期长且副产物柠檬酸积累较高等问题，造成生产成本过高且后续复杂的苹果酸分离纯化工艺，因此，构建一种高效生产苹果酸的黑曲霉菌株，以提高苹果酸的生产效率、缩短发酵周期并消除副产物十分必要。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的公开专利文献。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一株高效生产苹果酸的黑曲霉菌株、构建方法及应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一株高效生产苹果酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株，所述黑曲霉基因工程菌株是敲除了柠檬酸转运蛋白基因cexA，并过表达了黑曲霉来源的葡萄糖转运蛋白基因mstC、己糖激酶基因hxkA、磷酸果糖激酶基因pfkA和丙酮酸激酶基因pkiA的黑曲霉基因工程菌株。而且，所述基因cexA序列在NCBI-GeneID是4989494，所述基因mstC序列在NCBI-GeneID是4978840，所述hxkA基因在NCBI-GeneID是4979978，所述基因pfkA序列在NCBI-GeneID是4989727，所述基因pkiA序列在NCBI-GeneID是4982167。如上所述的高效生产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建方法，步骤如下：⑴消除副产物柠檬酸的黑曲霉基因工程菌株的构建步骤1，构建基因cexA敲除质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应分别扩增获得基因cexA的上游和下游同源重组序列片段；将所述基因cexA的上下游同源重组序列片段克隆到载体pLH594，构建基因cexA敲除质粒pLH623；步骤2，cexA基因敲除菌株的获得：将所述质粒pLH623转化至宿主菌株S575，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得cexA基因敲除菌株S895；⑵高效生产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建步骤1，构建mstC基因过表达质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因mstC序列片段；将所述基因mstC序列片段克隆到载体pLH509，构建基因mstC过表达质粒pLH684；所述基因mstC由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制，所述启动子PpkiA序列为SEQNO.4，长度为1035bp；步骤2，mstC基因过表达菌株的获得：将所述质粒pLH684转化至cexA基因敲除菌株S895，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得mstC基因过表达菌株S1006；步骤3，构建pfkA基因过表达质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因pfkA序列片段；将所述基因pfkA序列片段克隆到载体pLH454，构建基因pfkA过表达质粒pLH473；所述基因pfkA由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制；步骤4，构建hxkA基因过表达质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因hxkA序列片段；将所述基因hxkA序列片段克隆到载体pLH509，构建基因hxkA过表达质粒pLH667；所述基因hxkA由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制；步骤5，构建pfkA基因及hxkA基因组合过表达质粒：分别以pfkA基因过表达质粒pLH473及hxkA基因过表达质粒pLH667为模板，通过PCR反应扩增获得PgpdA-pfkA-Ttrpc序列片段和PpkiA-hxkA-Ttrpc序列片段；将所述PgpdA-pfkA-Ttrpc序列片段和PpkiA-hxkA-Ttrpc序列片段克隆到载体pLH331，构建pfkA基因及hxkA基因组合过表达质粒pLH727；步骤6，cexA基因敲除且mstC、hxkA和pfkA基因过表达菌株的获得：将所述质粒pLH727转化至cexA基因敲除且mstC基因过表达菌株S1006，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得cexA基因敲除且mstC、hxkA和pfkA基因过表达菌株S1078；步骤7，构建pkiA基因过表达质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因pkiA序列片段；将所述基因pkiA序列片段克隆到载体pLH509，构建基因hxkA过表达质粒pLH683；所述基因pkiA由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制；步骤8，cexA基因敲除且mstC、hxkA、pfkA和pkiA基因过表达菌株的获得：将所述质粒pLH683转化至cexA基因敲除且mstC、hxkA和pfkA基因过表达菌株S1078，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得cexA基因敲除且mstC、hxkA、pfkA和pkiA基因过表达菌株S1149，即得高效生产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。而且，所述载体pLH594的构建方法如下：合成双丙氨膦抗性基因Bar基因，然后将bar基因序列同时与经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH577进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞获得质粒pLH593；以质粒pLH593为模板，经PCR扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA、双丙氨膦抗性基因Bar和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列；然后将PgpdA启动子、bar基因和Ttrpc终止子序列同时与经KpnI/EcoRI双酶切线性化后的出发载体pLH334进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞获得质粒pLH594。而且，所述载体pLH509的构建方法如下：分别以黑曲霉和构巢曲霉基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrp本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高效生产苹果酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，其特征在于：所述黑曲霉基因工程菌株是敲除了柠檬酸转运蛋白基因cexA，并过表达了黑曲霉来源的葡萄糖转运蛋白基因mstC、己糖激酶基因hxkA、磷酸果糖激酶基因pfkA和丙酮酸激酶基因pkiA的黑曲霉基因工程菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一株高效生产苹果酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株，其特征在于：所述黑曲霉基因工程菌株是敲除了柠檬酸转运蛋白基因cexA，并过表达了黑曲霉来源的葡萄糖转运蛋白基因mstC、己糖激酶基因hxkA、磷酸果糖激酶基因pfkA和丙酮酸激酶基因pkiA的黑曲霉基因工程菌株。


2.根据权利要求1所述的高效生产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，其特征在于：所述基因cexA序列在NCBI-GeneID是4989494，所述基因mstC序列在NCBI-GeneID是4978840，所述hxkA基因在NCBI-GeneID是4979978，所述基因pfkA序列在NCBI-GeneID是4989727，所述基因pkiA序列在NCBI-GeneID是4982167。


3.如权利要求1或2所述的高效生产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴消除副产物柠檬酸的黑曲霉基因工程菌株的构建
步骤1，构建基因cexA敲除质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应分别扩增获得基因cexA的上游和下游同源重组序列片段；将所述基因cexA的上下游同源重组序列片段克隆到载体pLH594，构建基因cexA敲除质粒pLH623；
步骤2，cexA基因敲除菌株的获得：将所述质粒pLH623转化至宿主菌株S575，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得cexA基因敲除菌株S895；
⑵高效生产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建
步骤1，构建mstC基因过表达质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因mstC序列片段；将所述基因mstC序列片段克隆到载体pLH509，构建基因mstC过表达质粒pLH684；所述基因mstC由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制，所述启动子PpkiA序列为SEQNO.4，长度为1035bp；
步骤2，mstC基因过表达菌株的获得：将所述质粒pLH684转化至cexA基因敲除菌株S895，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得mstC基因过表达菌株S1006；
步骤3，构建pfkA基因过表达质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因pfkA序列片段；将所述基因pfkA序列片段克隆到载体pLH454，构建基因pfkA过表达质粒pLH473；所述基因pfkA由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制；
步骤4，构建hxkA基因过表达质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因hxkA序列片段；将所述基因hxkA序列片段克隆到载体pLH509，构建基因hxkA过表达质粒pLH667；所述基因hxkA由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制；
步骤5，构建pfkA基因及hxkA基因组合过表达质粒：分别以pfkA基因过表达质粒pLH473及hxkA基因过表达质粒pLH667为模板，通过PCR反应扩增获得PgpdA-pfkA-Ttrpc序列片段和PpkiA-hxkA-Ttrpc序列片段；将所述PgpdA-pfkA-Ttrpc序列片段和PpkiA-hxkA-Ttrpc序列片段克隆到载体pLH331，构建pfkA基因及hxkA基因组合过表达质粒pLH727；
步骤6，cexA基因敲除且mstC、hxkA和pfkA基因过表达菌株的获得：将所述质粒pLH727转化至cexA基因敲除且mstC基因过表达菌株S1006，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得cexA基因敲除且mstC、hxkA和pfkA基因过表达菌株S1078；
步骤7，构建pkiA基因过表达质粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因pkiA序列片段；将所述基因pkiA序列片段克隆到载体pLH509，构建基因hxkA过表达质粒pLH683；所述基因pkiA由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制；
步骤8，cexA基因敲除且mstC、hxkA、pfkA和pkiA基因过表达菌株的获得：
将所述质粒pLH683转化至cexA基因敲除且mstC、hxkA和pfkA基因过表达菌株S1078，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得cexA基因敲除且mstC、hxkA、pfkA和pkiA基因过表达菌株S1149，即得高效生产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。


4.根据权利要求3所述的高效生产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建方法，其特征在于：所述载体pLH594的构建方法如下：
合成双丙氨膦抗性基因Bar基因，然后将bar基因序列同时与经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH577进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞获得质粒pLH593；
以质粒pLH593为模板，经PCR扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA、双丙氨膦抗性基因Bar和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列；然后将PgpdA启动子、bar基因和Ttrpc终止子序列同时与经KpnI/EcoRI双酶切线性化后的出发载体pLH334进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞获得质粒pLH594。


5.根据权利要求3所述的高效生产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建方法，其特征在于：所述载...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘浩，徐永学，徐晴，黄和，曹威，
申请(专利权)人：天津科技大学，南京师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12