诱导金线莲种子萌发成苗的两株真菌制造技术

本发明专利技术公开了2株能够诱导金线莲种子萌发成苗的真菌。它们对于金线莲的有性繁殖和种苗的规模化生产和资源可持续利用具有重大应用价值。

【技术实现步骤摘要】
诱导金线莲种子萌发成苗的两株真菌
本专利技术涉及生物工程
，涉及2株能够诱导金线莲种子萌发成苗的真菌。
技术介绍
金线莲(Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.)为兰科开唇兰属植物金线兰(花叶开唇兰)的全草，在我国主要分布于福建、浙江、广东、广西、江西和云南等亚热带及热带区域，国外主要分布于日本、泰国等国家。它是我国民间珍稀名贵中草药，素有“药王”、“金草”之美称，主要含有多糖及糖苷类、黄酮类、生物碱和萜类等化学成分，具有降血糖、降血脂和保肝等药理作用。金线莲属中阴性植物，喜温暖、阴凉及潮湿的环境，从山涧常绿阔叶林或竹林下的枯枝落叶层、沟边、岩缝、石壁等阴湿处可偶尔发现稀疏、零星分布的金线莲，其适应性较窄。由于金线莲极低的自然繁殖率、独特的生长习性、人为肆意采挖和生态环境的破坏等原因导致了其野生资源的极度匮乏，远不能满足市场需求。目前，利用组培快繁技术进行金线莲茎段的无性繁殖或种子的有性繁殖，在一定程度上解决了金线莲资源再生困难的问题，但试管苗生长周期长，生产成本高；移入人工种植环境或自然环境后，试管苗的存活率低；存活下来的试管苗抗病能力低，养护难度大，且生长缓慢。更严重的问题是，人工种植生产的金线莲中黄酮、多糖等化学成分的含量远远低于野生金线莲的，药材质量差。这些问题的出现，与现行的繁殖技术没有充分遵循金线莲的自然生长规律有密切关系。兰科植物种子细小，结构简单，仅由种皮和胚组成，不具胚芽、胚根和子叶等构造，自然条件下种子的萌发率极低。兰科植物种子的胚是尚未分化、无胚乳的原胚，无法为种子萌发提供充足的养分。自然条件下，兰科植物种子与特定菌根真菌建立共生关系后，种子依赖真菌为其提供的营养而实现萌发，这种萌发方式被称为共生萌发，是兰科植物特有的。诱导兰科植物种子萌发的真菌被称为萌发菌。金线莲是兰科植物，根据兰科植物种子这一独特的生理特征，应用特定真菌诱导种子萌发的思路具有可信的理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供2株能够诱导金线莲种子萌发成苗的真菌。为解决金线莲资源紧缺的状况提供一条新的途径。本专利技术采用的2株真菌经鉴定均为角担菌Ceratobasidiumsp.，保藏编号分别为CGMCCNo.16994和CGMCCNo.16995。这2株真菌于2018年12月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2株真菌的保藏和存活证明见附件。2株真菌的培养特性分别为：CGMCCNO.16994：在PDA培养基上，菌落圆形，初期菌落奶油色，后期正面和背面均为浅黄色，气生菌丝不发达，25℃生长5天菌落直径为9cm；菌丝浅色、光滑、分支，有隔，常规培养基上不产生分生孢子。CGMCCNO.16995：在PDA培养基上，菌落圆形，初期菌落白色，中部菌丝较稀疏，边缘菌丝浓密，气生菌丝发达，绒毛状，毛状边缘，25℃生长5天菌落直径为9cm；菌丝浅色、光滑、分支，有隔，常规培养基上不产生分生孢子。本专利技术所述2株真菌的核糖体内转录间隔区(ITS)序列如序列表所示。本专利技术所述2株真菌可以用于实验室条件下金线莲种子共生萌发的研究，也可以与金线莲种子拌播，用于生产金线莲实生苗，它们在多种条件下均可以诱导金线莲种子萌发成苗，这些条件包括：实验室条件下播种育苗、温室条件下播种育苗和大棚条件下播种育苗。本专利技术的有益效果是：本专利技术所述的2株真菌具有诱导金线莲种子萌发成苗的生理活性，有助于解决金线莲种子在田间难以萌发的问题，并能增强幼苗适应性，具有较大的应用价值。具体实施方式实施例1水琼脂培养基中CGMCCNO.16994诱导金线莲种子萌发成苗的效果将金线莲种子播种于水琼脂培养基上，每个平皿中播种100-200粒种子，同时接种5个真菌CGMCCNO.16994菌片(4×4mm)，以水琼脂培养基播种但不接种真菌作为阴性对照，以MS培养基播种金线莲种子作为阳性对照，在培养室中培养，培养温度为23-27℃，初期为暗培养，开始形成原球茎后，改为光暗交替培养，光照时间12h/d，光照强度1500Lx。播种后每隔1周于解剖镜下观察种子萌发情况。种子萌发标准为种胚膨大形成白色原球茎，原球茎分化成苗的标准为形成具2个以上叶片的幼苗。萌发率和成苗率的计算公式分别为：萌发率＝萌发种子数/种子总数×100％，成苗率＝形成幼苗数/种子总数×100％。此标准及相应计算公式适用于本专利技术所有实施例。在该培养条件下，种子萌发过程表现为：与阳性对照相比，共生萌发种子萌发时间提前了1-2周，最早的1周即开始萌动，同时共生萌发种子的成苗时间也相应缩短；2个月时调查种子萌发情况，结果为：与真菌CGMCCNO.16994共生的金线莲种子的平均萌发率为70.9％，阳性对照种子的平均萌发率为60.4％，阴性对照种子的萌发率为0.0％；3个月时调查种子萌发成苗情况，结果为：与真菌CGMCCNO.16994共生的金线莲种子的平均成苗率为63.8％，阳性对照种子的平均成苗率为583％，阴性对照种子的成苗率为0.0％。实施例2固体基质中CGMCCNO.16995诱导金线莲种子萌发成苗的效果将金线莲种子播种于灭菌的锯末基质上，每个培养瓶中播种100-200粒种子，同时接种1个直径1.0cm的真菌CGMCCNO.16995菌片，以不接种真菌为对照，在培养室中培养，培养温度为23-27℃，初期为暗培养，开始形成原球茎后，改为光暗交替培养，光照时间12h/d，光照强度1500Lx。在该培养条件下培养约3周时即可在共生萌发种子的基质表面观察到由种子萌发形成的白色原球茎，同时对照种子的基质表面未观察到原球茎；2个月时调查种子萌发情况，结果为：与真菌CGMCCNO16995共生的金线莲种子的平均萌发率为67.2％，未接种真菌的对照金线莲种子的萌发率为0.0％；3个月时调查种子萌发成苗情况，结果为：与真菌CGMCCNO.16995共生的金线莲种子的平均成苗率为65.1％，未接种真菌的对照金线莲种子的萌发率和成苗率均为0.0％。实施例3温室条件下CGMCCNO.16995诱导金线莲种子萌发成苗的效果以发酵好的泥炭土和锯末为基质，将二者按3∶1配比充分混匀后装入花盆，花盆直径10cm、高10cm，然后将金线莲种子均匀撒播于基质表面，每个花盆中播种200-300粒种子，同时放入真菌CGMCCNO.16995的固体菌种0.5g，对照放入未接菌的锯末基质，在温室中培养，培养温度为15-28℃，空气相对湿度50％-80％，自然光照，以散射光为宜，培养期间保持周围环境通风、透气，培养初期以塑料膜覆盖花盆。在该培养条件下培养4-5周时即可在共生萌发种子的基质表面观察到由种子萌发形成的浅绿色原球茎，同时对照种子的基质表面未观察到原球茎，此时可揭开花盆上覆盖的塑料膜；4个月时调查种子萌发及成苗情况，结果为：与真菌CGMCCNO.16995共本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.诱导金线莲种子萌发成苗的2株真菌，它们的保藏编号分别为CGMCC No.16994和CGMCC No.16995，它们的分类命名为角担菌Ceratobasidium sp.，它们能用于金线莲的种子共生萌发研究，也可以在多种条件下与金线莲种子拌播，用于生产金线莲实生苗。/n

【技术特征摘要】
1.诱导金线莲种子萌发成苗的2株真菌，它们的保藏编号分别为CGMCCNo.16994和CGMCCNo.16995，它们的分类命名为角担菌Ceratobasidiumsp.，它们能用于金线莲的种子共生萌发研究，也可以在多种条件下与金线莲种子拌播，用于生产金线莲实生苗。
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【专利技术属性】
技术研发人员：郭顺星，孟志霞，陈晓梅，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11