改善真菌孢子的储存稳定性和适应性的方法技术

本发明专利技术涉及一种生产具有提高的萌发率的休眠的真菌结构体或器官的方法，该方法包括使所述休眠的结构体或器官经受包括热处理和随后的冷却期的程序；以及一种相关的固态发酵方法和由此生产的休眠的真菌结构体或器官。

Methods to improve storage stability and adaptability of fungal spores

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改善真菌孢子的储存稳定性和适应性的方法无论是用于防止各种真菌有害生物或昆虫害虫，还是用于改善植物健康，生物防治剂在植物保护领域中都变得越来越重要。尽管也有病毒可用作生物防治剂，但在该领域中使用的仍然主要是基于细菌和真菌的那些。基于真菌的生物防治剂的最突出的形式是被称为分生孢子以及芽生孢子的无性孢子，但其他真菌繁殖体也是有前景的候选者，如(微)菌核、子囊孢子、担子孢子、厚垣孢子或菌丝段。WO2017/117089公开了使用某种热处理来稳定细菌内生孢子、更特别是芽孢杆菌(Bacillus)属孢子的方法。与许多细菌孢子(如芽孢杆菌孢子)不同，许多真菌孢子不那么健壮，并且已证明难以以满足商业产品需要(特别是在一定温度下的可接受的储存稳定性)的形式提供真菌孢子。尽管在过去主要通过对每个真菌种单独开发改进的制剂来解决该问题，但仍然需要提供一种提高真菌孢子的储存稳定性的通用方法，该方法不需要大量的实验为每个菌种找到合适的制剂。此外，对于特别脆弱的真菌孢子(如属于绿僵菌(Metarhizium)属的那些)的情况，仍然希望提供在延长的保存期限内更加稳定的孢子。在本专利技术中已经至少部分地解决了该技术问题。因此，在一方面，本专利技术涉及一种生产具有提高的萌发率的休眠的真菌结构体或器官的方法，该方法包括使所述休眠的结构体或器官经受包括在37℃至65℃下的热处理以及随后在0℃至36℃的温度下的冷却期的程序。与本专利技术有关的休眠的真菌结构体或器官包括：真菌孢子，如分生孢子、子囊孢子、担子孢子、厚垣孢子和芽生孢子；以及其他休眠的结构体或器官，如所有发育阶段中(即在成熟期间和成熟之后)的菌核和微菌核。优选地，所述孢子为外生孢子，更优选分生孢子。还优选所述孢子为至少部分地成熟的孢子。最优选地，所述孢子为成熟孢子。如果在所有的发育阶段中都存在孢子，则优选其至少50％为成熟孢子。有关分生孢子发育的概述可见于例如Navarro-BordonabaandAdams(1994；DevelopmentofConidiaandFruitingBodiesinAscomycetes；EsserandLemke(编辑)-TheMycota；–I.Growth,DifferentiationandSexuality；Springer-VerlagISBN978-3-662-11910-5)中。从孢壁(在真菌孢子中，其主要由β-葡聚糖组成；在细菌孢子中，其主要由肽聚糖组成)组成开始，在细菌孢子和真菌孢子之间存在一些差异(Setlow，2007，TrendsinMicrobiology15(4):172-180；Wyatt等人，2013，AdvancedAppliedMicrobiology85:43-91)。此外，细菌孢子仅仅是为能够在恶劣环境条件下生存而专门产生的，而真菌孢子是一种繁殖手段。至少细菌芽孢杆菌属的孢子是内生孢子，即它们在细菌内形成。相比之下，真菌孢子——至少那些可用于植物保护中的真菌种——主要是外生孢子，这意味着它们源于真菌体外。此外，尽管已发现细菌孢子特别是内生孢子显示出高温耐受性，但真菌孢子对较高的温度更敏感。就本专利技术而言，“提高的萌发率”是指直至在所述孢子生产之后至少2周，即在完成冷却期之后至少2周，休眠的真菌结构体或器官、优选真菌孢子的萌发率，比未根据本专利技术的程序处理但以其他方式同等处理的休眠的真菌结构体或器官如孢子(“对照孢子”)的萌发率高至少10％、优选至少20％、更优选至少30％或至少40％且最优选至少50％。换言之，“提高的萌发率”意指直至在所述孢子生产之后至少2周，萌发率为对照孢子的萌发率的至少110％、优选至少120％、更优选至少130％或至少140％且最优选至少150％或更高。优选地，所述提高的萌发率直至在孢子生产之后至少3个月、更优选至少4个月并且最优选在孢子生产之后至少6个月如至少8个月、至少10个月或甚至12个月或更长仍然可见或甚至增加。因此，优选的是，在所述孢子生产之后3个月，根据本专利技术处理的孢子的萌发率为对照孢子的萌发率的至少200％。在另一个优选的实施方案中，在所述孢子生产之后6个月，萌发率为对照孢子的萌发率的至少300％或至少400％、最优选至少500％。在这一点上，萌发率表示孢子在给定时间之后仍然萌发的能力。因此，萌发率％意指在给定时间之后能够萌发的孢子的百分比。测量萌发率的方法在本领域中是众所周知的。例如，将孢子铺到琼脂培养基的表面上，并在合适的生长温度下孵育之后，通过显微镜测定发育出萌发管的孢子的比例(Oliveira等人，2015，AprotocolfordeterminationofconidialviabilityofthefungalentomopathogensBeauveriabassianaandMetarhiziumanisopliaefromcommercialproducts。JournalofMicrobiologicalMethods119；第44-52页，以及其中的参考文献)。与对照孢子或包含对照孢子的组合物相比，根据本专利技术的方法生产的休眠的真菌结构体或器官(如真菌孢子)或包含休眠的真菌结构体或器官(如真菌孢子)的组合物显示出增加的储存稳定性。与本专利技术有关的“储存稳定性”或“储存稳定的”意指真菌孢子在延长的时间内(长于24小时、优选长于48小时，如至少1周、至少4周、更优选至少1个月，如至少2个月或至少6个月)、优选在室温下、更优选还在孢子的萌发率未显著降低的情况下储存的能力。根据以上定义，商业产品中的储存稳定性可包括一定的保证萌发率，然而，该萌发率取决于初始孢子浓度和真菌种类。增加的储存稳定性是指，与通过相同的发酵方法在未根据本专利技术处理的情况下在相同的条件(如以相同的配方且在相同的温度下)下生产的孢子相比，所述休眠的真菌结构体或器官(如孢子)能够储存显著更长的时间。此外，根据本专利技术方法的休眠的真菌结构体或器官显示出代谢活性的改善的重新激活，如基于刃天青的氧化还原指示剂所显示的那样(参见“材料和方法”以及实施例7)。根据本专利技术的处理的另一积极效果是休眠的真菌结构体或器官特别是孢子获得更高的温度耐受性。温度耐受性在此定义为，与对照孢子相比，根据本专利技术生产的所述休眠的真菌结构体或器官在储存期间暴露于高温之后在含营养物的环境中重新激活代谢活性的能力。这些温度可高于根据本专利技术为引起这种对更高温度的耐受性而在生产期间所应用的热处理的那些温度。根据本专利技术的方法包括含热处理的程序。通常，能够产生孢子的最佳真菌生长温度范围为20℃至35℃。为提供根据本专利技术的热处理，温度应当在最佳生长温度或在为特定真菌发酵期间选择的温度之上5℃至30℃的范围内、优选在所述最佳生长温度或发酵温度之上10℃至20℃或在该范围之间的任意值。换言之，基于以上生长温度计，热处理期间所应用的温度被选择为37℃至65℃、优选37℃至55℃(如38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃或54℃)、更优选38℃至45℃。例如，对于绿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产具有提高的萌发率的休眠的真菌结构体或器官的方法，该方法包括使所述休眠的结构体或器官经受包括在37℃至65℃下的热处理以及随后在0℃至36℃的温度下的冷却期的程序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170920 EP 17192142.21.生产具有提高的萌发率的休眠的真菌结构体或器官的方法，该方法包括使所述休眠的结构体或器官经受包括在37℃至65℃下的热处理以及随后在0℃至36℃的温度下的冷却期的程序。


2.根据权利要求1所述的方法，还包括通过发酵生产所述休眠的真菌结构体或器官。


3.根据权利要求2所述的方法，其中在发酵期间或在发酵之后使所述休眠的真菌结构体或器官经受所述程序。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述休眠的真菌结构体或器官为外生孢子。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述休眠的真菌结构体或器官为发育中的孢子或成熟孢子。


6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述发酵为固态发酵。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述休眠的真菌结构体或器官为至少一种丝状真菌的孢子。


8.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少一种丝状真菌为昆虫病原真菌。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述昆虫病原真菌为绿僵菌属。


10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述昆虫病原真菌为棕色绿僵菌种和/或蝗绿僵菌种。


11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述昆虫病原真菌选自：球孢白僵菌，特别是菌株ATCC74040，菌株GHA(登记号ATCC74250)，菌株ATP02，菌株CG716，菌株IL197、IL12、IL236、IL10、IL131、IL116，菌株Bv025和菌株PPRI5339；蜡蚧轮枝菌，特别是菌株KV01、菌株DAOM198499、菌株DAOM216596的分生孢子；蜡蚧霉，特别是菌株VE6/CABI(＝IMI)268317/CBS102071/
ARSEF5128；棕色绿僵菌，菌株F52(DSM3884/ATCC90448)；蝗绿僵菌ARSEF324；蝗绿僵菌分离株IMI330189(ARSEF7486)；棕色绿僵菌菌株Cb15；莱氏野村菌；玫烟色棒束孢菌株apopka97，菌株FE9901；和布氏白僵菌。


12.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少一种丝状真菌为促进植物生长的真菌。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述促进植物生长的真菌选自：黄色蠕形霉，特别是菌株V117b；深绿木霉，特别是菌株编号V08/002387，菌株编号NMI编号V08/002388，菌株编号NMI编号V08/002389，菌株编号NMI编号V08/002390，菌株LC52，菌株LC52；哈茨木霉，特别是菌株ITEM908；疣孢漆斑菌，特别是菌株AARC-0255；拜莱青霉，特别是菌株ATCC22348和/或菌株ATCC22348和/或菌株ATCC20851；寡雄腐霉，特别是菌株DV74或M1(AT...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·兰弗，F·纽曼，T·施泰诺特，S·申克，
申请(专利权)人：拜耳作物科学生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE