提高真菌孢子的储存稳定性的方法技术

本发明专利技术涉及生产具有延长的储存稳定性的真菌孢子或延长真菌孢子的储存稳定性的方法，所述方法包括使真菌孢子经受干燥步骤以使残余水分含量为12％以下；以及涉及包含通过所述方法获得的真菌孢子的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高真菌孢子的储存稳定性的方法无论是用于防止各种真菌有害生物或昆虫害虫，还是用于改善植物健康，生物防治剂在植物保护领域中都变得越来越重要。尽管也有病毒可用作生物防治剂，但迄今为止在该领域中使用的主要是基于细菌和真菌的那些。基于真菌的生物防治剂的最突出的形式是被称为分生孢子以及芽生孢子的无性孢子，但其他真菌繁殖体也可能是有前景的防治剂，如(微)菌核、子囊孢子、担孢子、厚垣孢子或菌丝段。与许多基于细菌的孢子(如芽孢杆菌孢子)不同，许多真菌孢子不那么健壮，并且已证明难以以满足商业产品需要(特别是在一定温度下——如果可能通常在室温下——的可接受的储存稳定性)的形式提供真菌孢子。尽管在过去主要通过对每个真菌种单独开发改进的制剂来解决该问题，但仍然需要提供一种提高真菌孢子的储存稳定性的通用方法，该方法不需要大量的实验为每个菌种找到合适的制剂。关于水分含量对真菌孢子储存稳定性的影响存在不同的观点。Moore等人(BiocontrolScienceandTechnology1996,6:51-61)记载了4-5％的水分含量适于使用油储存或干燥储存将黄绿僵菌(M.flavoviridae)孢子储存3个月。最近，微囊化和真菌孢子干燥的组合方法被用于提高棕色绿僵菌(M.brunneum)菌株的储存稳定性(Przyklenk等人，2017,JournalofMicroencapsulation34(5):498–512)。然而，该使用层流和干燥器的两步干燥方法得到的孢子的存活率在三个月后仅为50％，而在六个月后为1％。值得注意的是，没有残余水分含量的报道，并且观察到干燥时有高损失。过去经常使用脱水来获得干燥的真菌孢子。Daoust等人JournalofInvertebratePathology1983,41:151-160使用该方法，使得金龟子绿僵菌(M.anisopliae)分生孢子12个月后储存稳定性达到35％。Kim等人(Mycobiology2014,42(1):59-65)报道了使用空气干燥来干燥球孢白僵菌(Beauveriabassiana)最长达140h，然而未进行长期实验。Horaczek和Viernstein(BiologicalControl2004,31:65–71)使用三种不同的干燥方法来尝试稳定真菌孢子。然而，仍然需要提供具有提高到商业水平的储存稳定性的真菌孢子。该技术问题在本专利技术中至少部分地得以解决。因此，在第一方面，本专利技术涉及生产具有延长的储存稳定性的真菌孢子或延长真菌孢子的储存稳定性的方法，所述方法包括使真菌孢子经受干燥步骤以使残余水分含量小于12％。真菌孢子包括有性形成的孢子(例如卵孢子、接合孢子或子囊孢子)和无性形成的孢子(例如分生孢子和厚垣孢子，还有夏孢子、冬孢子和黑粉菌孢子)。优选地，孢子是分生孢子。储存稳定性表示真菌孢子在给定时间后发芽的能力。特别地，商业水平的储存稳定性是指在室温下3个月后、优选在6个月后真菌孢子的发芽率至少为80％。与本专利技术有关的延长的储存稳定性意味着真菌孢子可以以至少80％的发芽率储存至少6个月。优选地，以该发芽率，真菌孢子可储存甚至8个月或甚至10个月或甚至12个月。从所附的实施例中可以明显看出，真菌孢子，例如棕色绿僵菌(Metarhiziumbrunneum)的孢子，更特别地是菌株F52，可最优选地以至少80％的发芽率保存甚至12个月。尽管优选在室温下存在储存稳定性，但它至少也将在较低温度下存在。较低的温度可始于4℃，优选10℃，更优选15℃。本专利技术发现，水分含量低于12％的干燥的真菌孢子有助于增强真菌孢子的储存稳定性。通常认为，水分含量越低，储存稳定性进一步提高。在某些情况下，可能不应将水分含量降低到一定阈值以下。孢子的干燥可以使用本领域已知的方法进行，特别是真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥或脱水。关于本专利技术，真菌孢子优选使用真空干燥来干燥。真空干燥是在减压环境下干燥材料的方法，其降低了快速干燥所需的热量。真空干燥器为热不稳定/热敏感材料提供低温干燥。根据本专利技术，在真空干燥过程中，通过产生真空或至少降低孢子所暴露的大气压来降低真菌孢子的水分含量。该技术背后的原理是将真菌孢子等物质暴露于低(较低)压力和(稍微)较高的温度下。当沸点随周围压力而降低时，需要较低的温度以更有效(更快)干燥，同时使材料不承受热应力。在本专利技术中可以使用任何种类的真空干燥器。然而，优选使用板式/台式干燥器和/或圆锥形干燥器。在本专利技术的过程中，出乎意料地发现，真空干燥在被用于降低真菌孢子的水分含量时甚至进一步提高了所述孢子的储存稳定性。人们通常认为真空干燥方法可能太苛刻，因为水分的流失会太快，低压可能会胁迫/破坏/退化能存活的孢子，但现在发现使用真空干燥将真菌孢子干燥至残余水分含量为低于12％，会产生更加储存稳定的孢子，即保质期延长的孢子。与本申请相关的残余水分含量或(残余)水含量与孢子中存在的水的含量有关。其可例如使用干燥秤来测量。该方法也称为“干燥失重”方法。示例性设置如下：将2-3g孢子粉样品放入干燥秤中，测量初始重量(起点)。之后，干燥秤将样品加热并测量随着时间推移而减少的重量(随着水的蒸发)。当重量保持恒定时，停止测量，计算重量损失并以初始重量的％表示，对应于残余水分。真菌孢子的最佳残余水分含量可能会根据孢子的类型和真菌种类而有所不同。关于本专利技术，真菌孢子的残余水分含量小于12％。通常，其可在1％至低于12％、优选1％至低于8％的范围内，例如在此之间的2％、3％、4％、5％、6％或7％或任何值，优选1.5％至6％，如2％或更低、3％或更低、4％或更低、5％或更低或6％或更低。为了清楚起见，如果没有另外说明，本申请中使用的％是指重量％。在本方法中，真空干燥优选进行最长达16小时。因此，干燥时间通常选择为16小时或更短的时间，例如30分钟至14小时，优选1至12小时，或介于此间的任何值，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个小时。在干燥过程中，孢子可以被搅动或保持原样。是否搅动孢子的决定尤其取决于孢子层的厚度。在本专利技术的过程中，已经发现，与文献中所描述的不同，较短的干燥过程适合于提高真菌孢子、特别是分生孢子的储存稳定性。取决于真菌的种类和孢子的类型以及初始水分含量，干燥时间的长度可能会有所不同。在一个优选的实施方案中，所述真空干燥在最高达40℃、优选最高达30℃(例如15℃至30℃或20℃至30℃)的温度下进行。在另一个优选的实施方案中，所述真空干燥在50至0.5mbar之间、优选在10至1mbar之间的压力下进行。在(真空)干燥过程中施加的温度和压力取决于真菌孢子，并且需要进行调整，这在技术人员的能力范围内是容易的。在一个优选的实施方案中，真菌孢子是分生孢子。分生孢子是一种由真菌形成的孢子。分生孢子是无性形成的，包括但不限于粉末孢子、anellospores、节孢子、瓶梗孢子和pynidiospores。与例如细菌孢子相反，分生孢子并不预期在非常恶劣的环境条件下生存。在一些实施方案中，分生孢子是疏水的。在其他本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产具有延长的储存稳定性的真菌孢子或延长真菌孢子的储存稳定性的方法，包括使真菌孢子经受干燥步骤以得到小于12％的残余水分含量。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180919 EP 18195351.41.生产具有延长的储存稳定性的真菌孢子或延长真菌孢子的储存稳定性的方法，包括使真菌孢子经受干燥步骤以得到小于12％的残余水分含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述残余水分含量为1.5重量％至6重量％。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述孢子在室温下在6个月后的发芽率至少为80％。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述干燥步骤包括真空干燥。


5.根据权利要求4所述的方法，其中进行所述真空干燥最多达16小时。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其中在最高达30℃的温度下进行所述真空干燥。


7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中在10-1mbar的压力下进行所述真空干燥。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述真菌孢子为分生孢子。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述真菌孢子来自在植物保护领域具有有益活性的真菌孢子。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述真菌具有杀真菌的、杀昆虫的、杀线虫的或除草的活性，或者支持和/或促进和/或激发植物健康和/或植物生长。


11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述真菌具有杀真菌活性并且选自盾壳霉，特别是菌株CON/M/91-8(登记号DSM-9660)(可作为Prophyta,DE的获得)；赫色小球壳孢的菌株P130A(ATCC74412)；黄曲霉，菌株NRRL21882(可作为Syngenta的Afla-获得)和菌株AF36(可作为ArizonaCottonResearchandProtectionCouncil,US的AF36获得)；粉红粘帚霉，来自AdjuvantsPlus的菌株321U；黄色蠕形霉，菌株VII7b；白粉寄生孢，特别是菌株AQ10(可作为IntrachemBioItalia的AQ获得)；链孢粘帚菌(同义词：链状粉红粘帚菌)，特别是菌株J1446(例如VerderaOy的)、菌株IK726、菌株88-710(WO2007/107000)、菌株CR7(WO2015/035504)；棘孢木霉，特别是来自Isagro的菌株ICC012或菌株SKT-1(例如来自KumiaiChemicalIndustry的ECO-)、菌株T34(例如BiocontrolTechnologiesS.L.,ES的T34Biocontrol)；绿色木霉，特别是菌株TV1(例如Koppert的Trianum-P)、菌株B35(Pietr等人，1993,Zesz.Nauk.ARwSzczecinie161:125-137)，深绿木霉，特别是菌株CNCMI-1237(例如来自Agrauxine,FR的WP)、国际申请PCT/IT2008/000196中记载的菌株SC1、菌株77B(来自AndermattBiocontrol的T77)、菌株编号V08/002387、菌株NMI编号V08/002388、菌株NMI编号V08/002389、菌株NMI编号V08/002390、菌株LC52(例如来自AgrimmTechnologiesLimited的Sentinel)、菌株LUI32(例如AgrimmTechnologiesLimited的Tenet)、菌株ATCC20476(IMI206040)、菌株T11(IMI352941/CECT20498)、菌株SKT-1(FERMP-16510)、菌株SKT-2(FERMP-16511)、菌株SKT-3(FERMP-17021)和枝状枝孢菌，例如菌株H39(StichtingDienstLandbouwkundigOnderzoek)。


12.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述真菌具有杀昆虫活性，并且选自C2.3球孢白僵菌，特别是菌株ATCC74040；菌株GHA(登记号ATCC74250)；菌株ATP02(登记号DSM24665)；菌株PPRI5339；菌株PPRI7315，菌株R444，菌株IL197、IL12、IL236、IL10、IL131、IL116；菌株BaGPK；菌株ICPE279，菌株CG716；C2.6蜡蚧轮枝菌(以前称为蜡蚧轮枝孢)，特别是菌株KV01、菌株DAOM198499或菌株DAOM216596的分生孢子；C2.9蜡蚧霉(原名蜡蚧轮枝孢)，特别是菌株VE6/CABI(＝IMI)268317/CBS102071/ARSEF5128；C2.10蝗绿僵菌，例如ARSEF324或分离株IMI330189(ARSEF7486)；C2.11棕色绿僵菌，例如菌株Cb15或菌株F52(DSM3884/ATCC90448)；C2.12金龟子绿僵菌复合种/菌株，例如菌株ESALQ1037，菌株E-9，菌株M206077，菌株C4-B(NRRL30905)，菌株ESC1，菌株15013-1(NRRL67073)，菌株3213-1(NRRL67074)，菌株C20091，菌株C20092，或菌株ICIPE78；C2.14玫烟色拟青霉(新名：玫烟色棒束孢)，特别是菌株Apopka97、Fe9901、ARSEF3581、ARSEF3302、ARSEF2679、IfB01(中国典型保藏物培养中心CCTCCM2012400的)、ESALQ1296、ESALQ1364、ESALQ1409、CG1228、KCHJ2、HIB-19、HIB-23、HIB-29、HIB-30、CHE-CNRCB304、EH-511/3、CHE-CNRCB303、CHE-CNRCB305、CHE-CNRCB307、EH-506/3、EH-503/3、EH-520/3、PFCAM、MBP、PSMB1、RCEF3304、PF01-N10(CCTCCNo.M207088)、CCM8367、SFP-198、K3、CLO55、IfTS01、IfTS02、IfTS07、P1、If-02、If-2.3、If-03、IfrAsC、PC-013(DSMZ26931)、P43A、PCC、Pf04、Pf59、Pf109、FG340、Pfr1、Pfr8、Pfr9、Pfr10、Pfr11、Pfr12、Ifr531、IF-1106、I9602、I7284、I03011(专利US4618578)、CNRCB1、SCAU-IFCF01、PF01-N4、Pfr-612、Pf-Tim、Pf-Tiz、Pf-Hal和Pf-Tic。


13.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述真菌具有杀线虫活性并且选自D2.1白黏帚菌，特别...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·M·施泰因文德，D·兰弗，F·纽曼，M·伍特克，
申请(专利权)人：拜耳作物科学生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE