二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物技术

本发明专利技术涉及抗体药物技术领域，特别涉及二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物。该二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，和b)特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，即scFv1‑CL或CL‑scFv1；或者包括：c)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和d)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链。本发明专利技术的二价双特异性抗体与第一抗原分子及第二抗原分子的亲和力均较高，轻重链正确装配率高，且分子大小适中。

【技术实现步骤摘要】
二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物
本专利技术涉及抗体药物
，特别涉及二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物。
技术介绍
双特异性抗体(bispecificmonoclonalantibody,BsAb)是一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体。双特异性抗体能够同时识别肿瘤靶细胞和免疫效应细胞，因此兼有抗体特异性和介导效应细胞的细胞毒作用的双重功能。双特异性抗体能将效应细胞聚集于肿瘤部位并激活效应细胞发挥抗肿瘤作用，其杀伤肿瘤细胞的作用机理包括细胞增殖、细胞因子释放、细胞毒性多肽和酶的调控。体内及临床研究证明双特异性抗体介导的免疫治疗可使部分动物的肿瘤缓解，临床上可使肿瘤患者病情减轻，延长生命。因此，双特异性抗体介导的免疫活性细胞在肿瘤治疗中的应用具有良好的前景。双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工制备。本领域中双或多特异性抗体能够结合2种以上抗原，可以利用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生。最近己经开发了广泛多样的重组双特异性抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Co1oma,M.J.,等,NatureBiotech.15(1997)159-163；WO2001077342；和Morrison,S.L.,NatureBiotech.25(2007)1233-1234)。此外，还开发了能够结合2种以上抗原的诸多其他新型形式，其中抗体中心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)不再保持如双抗体、三链抗体或四链抗体、minibodies和若干单链形式(scFv、Bis-scFv)(Holliger,P.,等，NatureBiotech.23(2005)1126-1136；Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobio1ogy74(2007)3-14；Shen,J.，等，Journa1ofImmunogica1Methods318(2007)65-74；Wu,C.，等.,NatureBiotech.25(2007)1290-1297)。在一种方法中，利用细胞杂交瘤(quadroma)技术(见Mi1stein,C.和A.C.Cue11o,Nature，305(1983)537-40)生成了与天然抗体非常类似的双特异性抗体，所述细胞杂交瘤技术基于表达具有所需的双特异性抗体特异性的鼠单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合。因为在产生的细胞杂交瘤细胞系中的两个不同抗体重链和轻链的随机配对，所以生成至多10种不同抗体类型，其中只有一种是所需的功能双特异性抗体。由于存在错配副产物和显著降低的产率，其意味着需要复杂的纯化程序(参见例如Morrison,S.L.,NatureBiotech25(2007)1233-1234)。一般地，如果使用重组表达技术，则相同的错配副产物问题仍存在。用于避开错配副产物问题的方法，称为“凸起一进入一孔洞(knobs-into-ho1es)”，目的在于通过将突变引入CH3结构域以修饰接触界面来迫使两个不同抗体重链配对。在一条链上，大体积氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换，以形成“孔洞”。相反地，将具有大侧链的氨基酸引入到另一个CH3结构域中，以形成“凸起”。通过共表达这两条重链，观察到与同型二聚体形式(“孔洞一孔洞”或“凸起-凸起”)相比高产率的异二聚体形式(“凸起-孔洞”)(Ridgway,J.B.,Presta,L.G.,Carter,P.和WO1996027011)，异二聚体的百分比可以通过利用噬菌体展示法重建两个CH3结构域的相互作用表面和引入二硫键来稳定该异二聚体而得到进一步增加(Merchant,A.M.，等,NatureBiotech16(1998)677-681；Atwell，S.,Ridgway,J.B.,Wells,J.A.，Carter，P.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。这种策略的一个重要制约是两个母体抗体的轻链必须相同，以防止错配和形成失活的分子。除“杵臼”结构之外，还可通过IgG和IgACH3的链交换(strand-exchangeengineereddomain，SEED)技术实现不同半抗体的Fc配对(Davis,J.H,等.,ProteinEng.Des.Sel.,2010,23(4):195-202.)。为了解决不同轻链正确装配的问题，近年来又开发了双细胞系分别表达半抗体、体外装配的新工艺。受到人体IgG4抗体在生理条件下自然发生的半抗体随机交换过程的启示，GenMab公司开发了FAE(Fab-armexchange)双功能抗体技术(Gramer,M.J,等.,MAbs2013,5(6):962-973.)。在两个目标抗体IgG1重链CH3区分别引入K409R和F405L两个点突变，就能够形成类似于IgG4抗体的半抗体交换重排。将突变后的两个不同IgG1抗体在两个CHO细胞系中分别表达并完成半抗体轻重链间的装配，经过蛋白A亲和纯化后，利用温和的氧化剂系统可在体外实现异源半抗体之间的精确装配。除了共用序列相同的轻链或进行体外装配，通过Crossmab技术也可促进抗体轻链的正确装配。代表产品是罗氏公司的Ang-2/VEGFCrossMabCH1-CL。Crossmab技术是在“杵臼”改造的基础上，将Ang-2抗体Fab结构域中的CL与CH1互换，而VEGF抗体的Fab结构则保持不变。经过改造的Ang-2抗体轻链不易与VEGF抗体的重链发生错配，同时“杵臼”结构可促进两条重链异源二聚化(Schaefer,W,等.,ProcNatl.Acad.Sci.USA,2011,108(27):11187-11192.)。此外，还可以将两个单链抗体(scFv)或者两个Fab通过肽段链接，形成双功能抗体片段。具有代表性的是德国Micromet公司开发的BiTE(bispecificT-cellengager)系列产品。该系列产品是将抗CD3单链抗体与不同抗肿瘤细胞表面抗原单链抗体通过肽段进行连接获得的(Baeuerle,P.A,等.,CancerRes.,2009,69(12):4941-4944.)。这类抗体结构的优点是分子量小、可以在原核细胞中表达、不需要考虑正确装配的问题；缺点是由于没有抗体Fc段，不能介导相应的生物学功能、半衰期短等。公开号为US2015/0284475A1和CN101896504A的专利中均公开了二价双特异性抗体，但两件专利中的二价双特异性抗体与抗原的亲和力较低。邵长利发表的《基于柔性链连接的双特异性抗体分子的设计和结构模拟》中的柔性肽结构对前述两件专利中的二价双特异性抗体进行改造，但抗体的亲和力依然不理想。针对上述双特异性抗体技术平台所具有的轻链错配，轻重链正确装配率不高或者分子偏大或偏小等问题，需要专利技术新型的二价双特异性抗体。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物。该抗体的轻重链正确装配率高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.二价双特异性抗体，其特征在于，其包括：/na)特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列；和/nb)特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL；/n或者包括：/nc)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和/nd)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中轻链可变区与柔性肽以及链接肽相连，重链可变区通过柔性肽以及链接肽与重链Fc片段相连。/n

【技术特征摘要】
1.二价双特异性抗体，其特征在于，其包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL；
或者包括：
c)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
d)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中轻链可变区与柔性肽以及链接肽相连，重链可变区通过柔性肽以及链接肽与重链Fc片段相连。


2.根据权利要求1所述的二价双特异性抗体，其特征在于，所述柔性肽为(G4S/G4SAS)n，n为大于或等于0的整数，且与柔性肽相连的IgG1铰链区部分序列为：EPKSCDK；
所述链接肽为L/GGGC，且与链接肽相连的重链铰链区第一个半胱氨酸残基突变为丝氨酸。


3.根据权利要求1或2所述的二价双特异性抗体，其特征在于，其中CL和CH1能形成异源二聚体，CL的末端半胱氨酸残基可以与重链的铰链区上的半胱氨酸残基形成二硫键。


4.根据权利要求1或2所述的二价双特异性抗体，其特征在于，其中一条重链的链接肽L/GGGC与一条轻链的链接肽L/GGGC的末端半胱氨酸残基能形成二硫键；和其中一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域被改变为促进形成所述二价双特异性抗体的结构。


5.根据权利要求4所述的二价双特异性抗体，其特征在于，所述改变为：
a)改变第一重链的CH3结构域：在与二价双特异性抗体内的第二重链的CH3结构域的初始界面相接触的第一重链的CH3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有大于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基，在第一重链的CH3结构域的界面内生成凸起，所述凸起可以定位在第二重链的CH3结构域的界面内的凹洞中；且
b)改变第二重链的CH3结构域：在与二价双特异性抗体内的第一重链的CH3结构域的初始界面相接触的第二重链的CH3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有小于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基，在第二重链的CH3结构域的界面内生成凹洞，在所述凹洞中可以定位第一重链的CH3结构域的界面内的凸起；
其中第一重链可变区与轻链可变区分别连接(G4S/G4SAS)n以及L/GGGC，并在两个L/GGGC的半胱氨酸残基之间形成二硫键。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的二价双特异性抗体，其特征在于，
所述具有大于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基由精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸组成；
所述具有小于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基由丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸组成。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的二价双特异性抗体，其特征在于，所述二价双特异性抗体包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，即SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，即SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯晓，金磊，王涛，郭洪瑞，刘爽，陈宇珩，韩宁，梁阳秋，
申请(专利权)人：长春金赛药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22