产生调节性免疫细胞的方法及其用途技术

本文提供了扩增调节性B细胞群体的方法，包括用IL‑4和CD40配体处理B细胞群体。本文还提供了扩增调节性T细胞群体的方法，包括在Treg扩增条件下扩增T细胞群体和选择CD9

Methods and applications of producing regulatory immune cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生调节性免疫细胞的方法及其用途本申请要求2017年6月22日提交的美国临时申请序列号62/523,637的优先权，其全部内容通过引用合并于此。序列表的引入于2018年6月22日创建的2KB大小(在MicrosoftWindows中测量)、名为“UTFCP1312WO.txt”的文件中包含的序列表已通过电子提交的方式提交，并通过引用并入本文。背景本专利技术是在卫生资源和服务管理局资助的HHSH234200737001C和HHSH250201000011C项目下利用政府支持完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。1.领域本专利技术总体上涉及医学和免疫学领域。更具体地，其涉及调节性B细胞和调节性T细胞的产生及其用途。2.相关技术描述调节性T细胞(Tregs)和调节性B细胞(Bregs)可以抑制免疫反应，并在自身免疫性疾病中发挥重要作用，提供移植耐受性。由于外周血仅包含小比例的这些抑制性免疫细胞，因此离体扩增方法被用于产生足够数量的抑制性细胞用于体内治疗或预防免疫相关疾病。目前用于Treg扩增的方案包括TCR连接和IL-2(He等，2016)，而用于Breg扩增的方法包括BCR连接和CD40配体(Taitano等，2016)。但是，免疫疗法(例如用于炎症性疾病)通常需要大量细胞，因此至关重要的是优化诱导体外T或B细胞增殖的方法，以使产生的Treg或Breg的数量最大化，并且使生产足量的抑制细胞所需的时间最小化。因此，迫切需要有效的分离和扩增方法来产生Treg或Breg，以用于治疗各种免疫疾病，包括自身免疫、感染、癌症和cGVHD。概述因此，本公开的某些实施方案提供了涉及Treg或Breg的扩增的方法和组合物，以及使用这些抑制性免疫细胞治疗和/或预防免疫介导的疾病的方法。在第一个实施方案中，提供了体外扩增Treg的方法，该方法包括获得CD4+T细胞的群体(例如分离的群体)；在Treg扩增条件下培养CD4+T细胞群体，从而产生扩增的Treg；以及从扩增的Tregs中选择CD9+细胞，从而获得CD9+Tregs群体。在一些方面，CD4+T细胞被进一步限定为CD4+CD25+T细胞，例如CD4+CD25+CD9+T细胞。在某些方面，选择进一步限定为正选择。在其他方面，选择进一步被限定为负选择。在一些方面，选择包括分选CD9+Treg。在特定方面，分选进一步限定为抗体珠选择、荧光相关细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)。在一些方面，Treg扩增条件包括在TCR连接、IL-2和mTOR抑制剂存在下培养CD4+T细胞。在特定方面，TCR连接包含抗CD3抗体和抗CD28抗体。在某些方面，mTOR抑制剂是雷帕霉素。在一些方面，Treg扩增条件还包括在肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)激动剂、全反式维甲酸(ATRA)，腺苷受体(A2AR)和/或A2AR激动剂存在下培养CD4+T细胞。在特定方面，培养持续10-14天，8-10天，9-15天或12-16天，例如8、9、10、11、12、13、14、15或16天。在某些方面，获得CD4+T细胞群体包括从干细胞、骨髓、外周血或脐带血中分离T细胞。在特定方面，获得CD4+T细胞群体包括从合并的脐带血、例如合并的脐带血中分离T细胞。在一些方面，分离包括进行抗体珠选择或FACS。在另外的方面，将CD4+T细胞或Tregs改造为糖皮质激素受体的表达降低或基本上没有表达。在一些方面，使用一种或多种指导RNA和Cas9酶工程改造所述CD4+T细胞或Treg。在其他方面，将CD4+T细胞或Tregs工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。在一些方面，将CD4+T细胞或Tregs工程化以表达自杀基因。在某些方面，自杀基因是CD20，CD52，EGFRv3或诱导型胱天蛋白酶9。在另一个实施方案中，提供了根据以上实施方案和方面或本公开中描述的任何方法产生的CD9+调节性T细胞群体。在另一个实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含所述实施方案的CD9+调节性T细胞群体和药学上可接受的载体。在又一个实施方案中，提供了一种体外扩增抑制性调节性B细胞(Bregs)的方法，该方法包括获得B细胞群体(例如，分离的群体)；在IL-4、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)和CD40配体(CD40L)存在的情况下培养B细胞；以及在IL-21，CD40L和选自FOXO1抑制剂、mTOR抑制剂和STAT6抑制剂的至少一种抑制剂的存在下进一步扩增B细胞，从而产生抑制性Bregs。在一些方面，扩增培养物可在一个或多个培养步骤中包含一种或多种其他细胞因子。在一些方面，所述其他细胞因子是IL-33。在某些方面，在IL-4、CpG和CD40L存在下的培养进一步包括FOXO1抑制剂、mTOR抑制剂和/或STAT6抑制剂的存在。在一些方面，该方法进一步包括在扩增步骤之前洗涤B细胞。在某些方面，可用新的培养基替换培养基，例如在扩增的任何阶段替换一半的培养基。在一些方面，培养基更换是在培养和扩增步骤之间，例如包含IL-4和信号传导抑制剂的培养基。在特定方面，CD40L是可溶性CD40L(sCD40L)。在一些方面，FOXO1抑制剂是AS1842856或AS1708727。在特定方面，FOXO1抑制剂是AS1842856。在一些方面，mTOR抑制剂是托基尼(torkinib)、雷帕霉素(rapamycin)、依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、地福莫司(deforolimus)、BGT226、SF1126、BEZ235、吉达列西(Gedatolisib)或SF1101。在特定方面，mTOR抑制剂是托基尼。在一些方面，STAT6抑制剂是AS1517499或来氟米特。在特定方面，STAT6抑制剂是AS1517499。在其他方面，该方法进一步包括使Breg与抗miR-155接触。可在扩增方法的任何阶段使Bregs与抗miR-155接触。在一些方面，在IL-21、CD40L和至少一种抑制剂存在下扩增后，使Breg与抗miR-155接触。在一些方面，获得B细胞群体包括从血液样品中分离B细胞。在某些方面，分离包括进行抗体珠选择或FACS。在某些方面，血液样品是外周血或脐带血。在一些方面，脐带血是从2个或更多个个体脐带血单位，例如3、4或5个个体脐带血单位中汇集的。在某些方面，B细胞群体是CB单个核细胞(CBMC)。在某些方面，B细胞群体是CD5+CD1dhiB细胞。在特定方面，B细胞群体是总B细胞。在某些方面，Breg具有抑制CD4+T细胞(例如，活化的CD4+T细胞)增殖的能力，例如抑制至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。在特定方面，Breg是人Breg。在某些方面，培养持续1至5天，例如2、3或4天。在某些方面，扩增持续5到10天，例如6、7、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.体外扩增CD9

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170622 US 62/523,6371.体外扩增CD9+调节性T细胞(Tregs)的方法，包括：
(a)获得CD4+T细胞群体；
(b)在Treg扩增条件下培养所述CD4+T细胞群体，从而产生扩增的Treg；和
(c)从扩增的Treg中选择CD9+细胞，从而获得CD9+Treg群体。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD4+T细胞被进一步限定为CD4+CD25+T细胞。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中选择进一步限定为正选择。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其中选择进一步限定为负选择。


5.根据权利要求1或2所述的方法，其中选择包括分选CD9+Treg。


6.根据权利要求5所述的方法，其中分选进一步限定为抗体珠选择、荧光相关细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)。


7.根据权利要求1所述的方法，其中Treg扩增条件包括在TCR连接、IL-2和mTOR抑制剂存在下培养CD4+T细胞。


8.根据权利要求7所述的方法，其中TCR连接包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。


9.根据权利要求7所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。


10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述Treg扩增条件还包括在肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)激动剂、全反式维甲酸(ATRA)、腺苷受体(A2AR)和/或A2AR激动剂存在下培养所述CD4+T细胞。


11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述培养持续10-14天。


12.根据权利要求1所述的方法，其中获得CD4+T细胞群体包括从干细胞、骨髓、外周血或脐带血中分离T细胞。


13.根据权利要求1所述的方法，其中获得CD4+T细胞群体包括从汇集的脐带血中分离T细胞。


14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中分离包括进行抗体珠选择或荧光相关细胞分选(FACS)。


15.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD4+T细胞或Treg被工程化以具有降低的糖皮质激素受体表达或基本上没有糖皮质激素受体表达。


16.根据权利要求15所述的方法，其中所述CD4+T细胞或Treg使用一种或多种指导RNA和Cas9酶进行工程化。


17.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD4+T细胞或Treg被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。


18.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD4+T细胞或Treg被工程化以表达自杀基因。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述自杀基因是CD20、CD52、EGFRv3或诱导型胱天蛋白酶9。


20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法产生的CD9+调节性T细胞群体。


21.药物组合物，其包含权利要求20所述的CD9+调节性T细胞群体和药学上可接受的载体。


22.一种体外扩增抑制性的调节性B细胞(Bregs)的方法，包括：
(a)获得B细胞群体；
(b)在IL-4、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)和CD40配体(CD40L)存在下培养B细胞；和
(c)在IL-21、CD40L和选自FOXO1抑制剂、mTOR抑制剂和STAT6抑制剂的至少一种抑制剂存在下进一步扩增B细胞，从而产生抑制性Breg。


23.权利要求22的方法，其中步骤(b)和/或步骤(c)进一步包含一种或多种其他细胞因子。


24.根据权利要求23所述的方法，其中所述其他细胞因子是IL-33。


25.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中步骤(b)的培养还包括存在FOXO1抑制剂、mTOR抑制剂和/或STAT6抑制剂。


26.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括在所述扩增步骤之前洗涤所述B细胞。


27.根据权利要求22所述的方法，其中CD40L是可溶性CD40L(sCD40L)。


28.根据权利要求22所述的方法，其中所述FOXO1抑制剂是AS1842856或AS1708727。


29.根据权利要求22所述的方法，其中所述FOXO1抑制剂是AS1842856。


30.根据权利要求22所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是托基尼、雷帕霉素、依维莫司...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·雷兹瓦尼，E·什帕尔，R·巴萨，
申请(专利权)人：得克萨斯大学体系董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US