新型冠状病毒更早期筛查方法技术

本发明专利技术的一种新型冠状病毒更早期筛查方法，可以检测新型冠状病毒，特别是用于在早期筛查SARS‑CoV‑2IgA抗体。试剂盒含有，作为R1的SARS‑CoV‑2磁珠包被物：含包被SARS‑CoV‑2重组抗原的磁珠包被物三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH值为7.1‑7.4；作为R2的抗人IgA抗体吖啶酯标记物：为含有吖啶酯标记鼠抗人IgA单克隆抗体的2‑(N‑吗啉)乙磺酸缓冲液。本发明专利技术的试剂盒及SARS‑CoV‑2IgA抗体免疫检测试剂，可用于更早期补充诊断新冠肺炎，且具有检测结果精确的特点。

Novel coronavirus screening method at a more early stage

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒更早期筛查方法
本专利技术涉及免疫检测
，特别是涉及一种新型冠状病毒感染肺炎(新冠肺炎)的SARS-CoV-2IgA抗体的更早期筛查方法、试剂及其试剂盒。
技术介绍
新型冠状病毒感染肺炎(新冠肺炎)作为急性呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理。新冠肺炎一般感染SARS-CoV-2(SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2)后3-7天发病，症状以发热、干咳、乏力为主，亦可伴随鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等。轻型患者无肺炎表现，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是重型、危重型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。因此能高效率检出新冠肺炎患者并预判出重型肺炎患者很有意义。最开始被采用的是病毒核酸检测试剂，用于新冠肺炎的确诊。因其检出率低，许多企业开始研发SARS-CoV-2IgG、IgM快速检测试剂盒，包括胶体金法、化学发光免疫分析法。第七版新冠肺炎诊疗方案纳入IgM、IgG血清学检测作为实验室诊断手段。目前已注册的产品有11个核酸检测产品，6个抗体检测产品，后者包括：胶体金法新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒、胶体金法新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒、磁微粒化学发光法新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒、磁微粒化学发光法新型冠状病毒(2019-nCoV)IgG抗体检测试剂盒、学发光微粒子免疫检测法新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒。因为SARS-CoV-2感染下呼吸道，患者少咳痰，采用咽拭子有很大机率采集样本失败。核酸检测试剂对新冠肺炎的检出率低，敏感性只有30-50％，不能满足将所有患者筛选出来的需求。测总抗体提高了敏感性但不能有效分辨患者处于病程哪个时期，是否还具传染性。胶体金法检测简便快速，但准确性不够。化学发光法测IgM、IgG抗体敏感性、特异性均高，但是两者的窗口期较长，IgM要发病3-5天后检出，IgG要恢复期检测值升高4倍以上才能诊断。因此，目前公开的技术在在检测新型冠状病毒方面检测时间滞后，检测结果有待提高。目前尚无关于IgA用于新冠肺炎筛选检测的报导，也没有IgA检测试剂盒研发成功的报导。
技术实现思路
本专利技术的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种能够更早检测SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒及其试剂。本专利技术的目的通过以下技术措施实现。提供一种检测SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒。优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，用于在早期筛查SARS-CoV-2IgA抗体。优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，作为R1的SARS-CoV-2磁珠包被物：含包被SARS-CoV-2重组抗原的磁珠包被物三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH值为7.1-7.4；作为R2的抗人IgA抗体吖啶酯标记物：为含有吖啶酯标记鼠抗人IgA单克隆抗体的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的人胚肾细胞株HEK293F中表达的刺突蛋白，简称S蛋白(Spikeprotein,S蛋白)，截取RBD结构域Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表达；蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用ProteinA柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用ProteinA柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6Histag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过ProteinA柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合ProteinA柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白。另一优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的用细菌表达的核衣壳蛋白，简称N蛋白，N蛋白是截取Met1-Ala419位氨基酸序列进行表达的；蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6Histag并克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅拌10-20min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一的N蛋白。优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液内含0.05-0.2％吐温20(v/v)、2-8％牛血清白蛋白(w/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)；2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液含有0.05-0.2％吐温20(v/v)、2-8％牛血清白蛋白(w/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，还含有：作为R3的反应缓冲液：含羊抗人IgG抗体的磷酸盐缓冲液，内含0.05-0.2％吐温20(v/v)、2-8％牛血清白蛋白(w/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)；SARS-CoV-2IgA阴性对照：为SARS-CoV-2IgA阴性血清；SARS-CoV-2IgA阳性对照：为人源性纯化SARS-CoV-2IgM抗体；阴阳性对照信息卡：含有阴阳性对照的发光值，用于筛选时的校正。另一优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，含有，测试卡：由SARS-CoV-2IgA测试条和塑料盒组成；测试条含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸、PVC板支持物组成；硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2抗原。优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，还含有作为样本稀释液的Tris盐酸缓冲液，Tris盐酸缓冲液的pH值为7.1-7.4，内含0.5-2％的牛血清白蛋白(w/v)、0.05-0.2％吐温20(v/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。本专利技术还提供一种检测SARS-CoV-2IgA抗体的试剂在制备上述用于筛查新型冠状病毒感染试剂或者试剂盒中的用途。本专利技术用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒及其检测试剂，可以检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒。/n

【技术特征摘要】
1.检测SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒。


2.根据权利要求1所述的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，其特征在于：用于在早期筛查SARS-CoV-2IgA抗体。


3.根据权利要求2项所述的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，其特征在于：含有，
作为R1的SARS-CoV-2磁珠包被物：含包被SARS-CoV-2重组抗原的磁珠包被物三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH值为7.1-7.4；
作为R2的抗人IgA抗体吖啶酯标记物：为含有吖啶酯标记鼠抗人IgA单克隆抗体的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。


4.根据权利要3所述的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，其特征在于：SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的人胚肾细胞株HEK293F中表达的刺突蛋白，简称S蛋白，截取RBD结构域Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表达；
蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用ProteinA柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用ProteinA柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6Histag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过ProteinA柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合ProteinA柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白。


5.根据权利要3所述的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，其特征在于：SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的用细菌表达的核衣壳蛋白，简称N蛋白，N蛋白是截取Met1-Ala419位氨基酸序列进行表达的；
蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6Histag并克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后...

【专利技术属性】
技术研发人员：金腾川，姜德华，马欢，常志远，曾威红，易如婷，黄文喜，
申请(专利权)人：广州市康润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44