一种同时测定人参皂苷Rb制造技术

本发明专利技术公开了一种利用高效液相色谱法同时测定人参皂苷Ra

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定人参皂苷Rb1、Rc、Ra1、Ra2、Ra3的含量测定方法
本专利技术涉及采用HPLC法同时测定人参属植物及其相关制品中人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rc含量的方法，属于中医药领域的专利技术创造。
技术介绍
人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd为最早被发现的人参皂苷类化合物，在人参属植物化学成分及生物活性研究中一直占据着非常重要的位置。我国2015年版药典一部中的人参、西洋参、红参、人参茎叶总皂苷、人参总皂苷、三七、三七三醇皂苷、三七总皂苷的含量测定项下测定的人参皂苷涉及到这些人参皂苷中的至少两种。另外2003年2月由当时的中华人民共和国卫生部发布的《保健食品检验与评价技术规范》中的《保健食品中人参皂甙高效液相色谱测定》中测定的是人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd共6种人参皂苷。除了上述法定的含量测定方法外关于人参属植物及其不同药用部位中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量测定的文献则多达几百篇，其中不论是何种人参皂苷的含量测定方法，绝大部分采用的是高效液相色谱法，而且固定相采用的是十八烷基硅烷键合硅胶(C-18或ODS)，流动相一般是乙腈-水、甲醇-水或乙腈-0.1％磷酸水溶液梯度洗脱。人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3是人们发现人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd之后不久发现的人参皂苷，极性大于上述人参皂苷。至今为止关于人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3的生物活性、含量测定等方面的研究几乎未见报道，这可能与这些皂苷分离纯化难度较大有关。尤其在含量测定方面近年来除了本专利技术人等【张佳音.人参中高级性人参皂苷类成分的研究[D].吉林大学，2017.】发表的采用Unitary-C18(4.6mm×250mm,5μm,100A)色谱柱，以乙腈-磷酸水溶液为流动相，在203nm波长下测定多种人参属植物中人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3的含量的测定方法外未见其他报道。本专利技术人接下来进行的关于上述人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3的含量测定的进一步研究表明，因此不能用于人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3的准确定量分析。至于利用高效液相色谱法同时测定人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rc含量的方法更是未见报道。
技术实现思路
本专利技术人至今仍然继续着关于人参皂苷的提取分离、结构鉴定及含量测定方法等方面的研究，并在最近完成了本专利技术，即首次建立了一种新的利用高效液相色谱法同时测定人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rc含量的方法。本专利技术人首次发现了现有技术中存在的问题，即利用已有技术当选择十八烷基硅烷键合硅胶(C-18或ODS)色谱柱，利用高效液相色谱法进行常见人参皂苷的含量测定时，由于不能使人参皂苷Ra1与Rc、人参皂苷Ra3与Rb1完全分离，从而不能正确测定人参皂苷Rb1、Rc、Ra1、Ra3的缺陷，具体过程及研究结果如下。按照2015版中国药典中人参皂苷含量测定的高效液相色谱条件，选用常用的ODS柱(AgilentZORBAXSB-C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱)，流动相以乙腈(B)和水(A)梯度洗脱：0～35min，19％B；35～55min，19～29％B；55～70min，29％B；70～100min，29～40％B；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长：203nm，进样体积：20μL，考察了8种人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd分离效果。实验结果见附图1。色谱图中只出现6个色谱峰，说明上述HPLC条件不能将上述8种人参皂苷完全分开。通过加标方法，即向该混标溶液中依次加入Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd单标溶液，确认各成分对应的色谱峰。结果发现，人参皂苷Ra1、Rc在同一位置出峰，人参皂苷Ra3、Rb1在同一位置出峰，即在上述条件下人参皂苷Ra1、Rc重叠，人参皂苷Ra3、Rb1重叠。色谱峰对应的人参皂苷如下：色谱峰1-人参皂苷Ra2；色谱峰2-人参皂苷Rb1+人参皂苷Ra3；色谱峰3-人参皂苷Rc+人参皂苷Ra1；色谱峰4-人参皂苷Rb2；色谱峰5-人参皂苷Rb3；色谱峰6-人参皂苷Rd。为了排除该色谱柱柱效低或不同色谱柱分离能力存在差异等因素，本实验接着选用其它四种不同厂家不同型号的C-18色谱柱，按上述液相条件继续考察了对上述8种人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd的分离效果。这些色谱柱分别为TnatureC18(4.6×250mm,5μm)、UnitaryC18(4.6×250mm,5μm,100A)、COSMOSILC18-AR-II(4.6×250mm,5μm)和AgilentEclipseXDB-C18(4.6×250mm,5μm)。实验结果见附图2-5。实验结果表明，四种不同型号的C-18色谱柱分离效果相近，均不能将人参皂苷Ra3、Rb1分开，也不能将人参皂苷Ra1、Rc完全分开。人参皂苷Ra1、Rc仍然在同一位置出峰，人参皂苷Ra3、Rb1仍然在同一位置出峰，即人参皂苷Ra1和Rc重叠，人参皂苷Ra3和Rb1重叠。色谱峰对应的人参皂苷如下：色谱峰1-人参皂苷Ra2；色谱峰2-人参皂苷Rb1+人参皂苷Ra3；色谱峰3-人参皂苷Rc+人参皂苷Ra1；色谱峰4-人参皂苷Rb2；色谱峰5-人参皂苷Rb3；色谱峰6-人参皂苷Rd。同样2003年2月发布的《保健食品检验与评价技术规范》中的《保健食品中人参皂甙高效液相色谱测定》中采用的方法也不能将人参皂苷Ra3、Rb1分开，也不能将人参皂苷Ra1、Rc完全分开；人参皂苷Ra1、Rc仍然在同一位置出峰，人参皂苷Ra3、Rb1仍然在同一位置出峰，即人参皂苷Ra1和Rc重叠，人参皂苷Ra3和Rb1重叠的问题。色谱图见附图6-10。图中第一个峰为人参皂苷Ra3和Rb1，第二个峰为人参皂苷Ra1和Rc。上述研究结果表明，利用ODS色谱柱无法准确测定Rb1、Rc、Ra1、Ra2、Ra3的含量。为了解决现有技术中存在的上述重大缺陷，本专利技术筛选了多种不同固定相的色谱柱及流动相对人参皂苷Rb1、Rc、Ra1、Ra2、Ra3的分离效果，最终发现酰胺色谱柱对人参皂苷Rb1、Rc、Ra1、Ra2、Ra3具有很好的分离效果。酰胺色谱柱固定相为二氧化硅与氨基或酰胺基等的衍生物，其流动相为与水混溶的有机溶剂。当流动相流经固定相时，固定相表面会建立富水层，使得待分析物在流动相和亲水层之间分配，特别适用于分离亲水性物质和极性较大的化合物。因此本实验考察了酰胺色谱柱对8种亲水性人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Ra1、Ra2、Ra3的分离效果。色谱柱为AcchromXAmide(5μm,100A,4.6×250mm)酰胺柱，流动相为乙腈(B)和水(A)，梯度洗脱条件：0～30min，10～18％A；30～60min，18～15％A。流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长：203nm。附图11为酰胺色谱柱分离8种亲水性人参皂苷的HPLC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时测定人参皂苷Rb

【技术特征摘要】
1.一种同时测定人参皂苷Rb1、Rc、Ra1、Ra2、Ra3的含量测定方法，其特征在于所用色谱柱为酰胺色谱柱。


2.权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所用流动相为乙腈(B)和水(A)，梯度洗脱条件：0～30min，10～18％A；30～60min，18～15％A。流速1.0mL/min。


3.权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于柱温为30℃。


4.权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于检测器。


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【专利技术属性】
技术研发人员：金永日，李绪文，王紫琪，张佳音，马双成，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22