一种骨髓间充质干细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种骨髓间充质干细胞的培养方法，本发明专利技术的培养方法是将骨髓里的杂细胞去除之后，将密质骨进行培养获得的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞在紧贴密质骨生长，长出的原代细胞都为骨髓间充质干细胞，生长状态好，细胞生长整齐，无需进一步纯化，给后期间充质干细胞的应用带来了方便。

A culture method of bone marrow mesenchymal stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种骨髓间充质干细胞的培养方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种骨髓间充质干细胞的培养方法。
技术介绍
间充质干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化能力的干细胞，可修复做种组织器官损伤，是干细胞治疗的优选种子细胞。间充质干细胞存在于各种组织和器官，其中包括骨髓、毛囊、脐带、牙髓、心脏等组织，尤以骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞最常见。不同来源的干细胞其分化能力存在差异，骨髓间充质干细胞以其优良的多向分化功能成为研究的热点。骨髓间充质干细胞存在于骨髓和骨密质中，目前常用的提取方法是冲洗骨髓细胞，之后进行梯度离心分离。因为骨髓中存在着血细胞、造血干细胞和各种免疫细胞，从而造成细胞难易纯化。杂细胞干扰试验结果和治疗效果，给后期干细胞的应用带来极大的困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种骨髓间充质干细胞的培养方法。本专利技术的技术方案如下：一种骨髓间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)将实验哺乳动物处死并经乙醇水溶液浸泡消毒，将肌肉和肌腱剥离干净后分离出股骨、肱骨和胫骨，然后仔细擦净其上覆盖的软组织，接着置于含有0.08-0.12％双抗和1.8-2.2％FBS的间充质干细胞完全培养基中；(2)去除上述股骨、肱骨和胫骨的骨髓腔末端的骨骺，接着用间充质干细胞完全培养基将骨髓腔中的骨髓冲出并反复冲洗至股骨、肱骨和胫骨变白；(3)将变白的股骨、肱骨和胫骨剪成1-3mm3的碎片，用含有0.8-1.2mg/mL胶原酶II于36-38℃消化0.5-2h至碎片变得松散，弃掉消化液得消化碎片；(4)将消化碎片用间充质干细胞完全培养基冲洗后，置于含有8-12％FBS的间充质干细胞完全培养基中，于4-6％CO2培养箱36-38℃培养3-7d；(5)倒掉培养基，以去除非粘附细胞和组织碎片，换上新鲜的含有8-12％FBS的间充质干细胞完全培养基，于4-6％CO2培养箱36-38℃培养4.8-5.2d；(6)倒掉培养基，加入含有0.015-0.024％EDTA的胰蛋白酶，室温下消化1-5min，然后按1∶3-4的比例进行传代，换上新鲜的含有8-12％FBS的间充质干细胞完全培养基，于4-6％CO2培养箱36-38℃培养；(7)每隔45-50h更换新鲜的含有8-12％FBS的间充质干细胞完全培养基，每周按1∶3-4传代1-2次，第3-8代用于体内或体外实验；上述间充质干细胞完全培养基为含有2-15wt％胎牛血清的DMEM培养基。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将实验哺乳动物处死并经乙醇水溶液浸泡消毒，将肌肉和肌腱剥离干净后分离出股骨、肱骨和胫骨，然后仔细擦净其上覆盖的软组织，接着置于含有0.1％双抗和2.0％FBS的间充质干细胞完全培养基中。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(3)为：将变白的股骨、肱骨和胫骨剪成1-3mm3的碎片，用含有1.0mg/mL胶原酶II的间充质干细胞于37℃消化1-2h至碎片变得松散，弃掉消化液得消化碎片。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(4)为：将消化碎片用间充质干细胞完全培养基冲洗后，置于含有10％FBS的间充质干细胞完全培养基中，于5％CO2培养箱36-38℃培养3d。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(5)为：倒掉培养基，以去除非粘附细胞和组织碎片，换上新鲜的含有10％FBS的间充质干细胞完全培养基，于5％CO2培养箱37℃培养5d。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(6)为：倒掉培养基，加入含有0.02％EDTA的胰蛋白酶，室温下消化3min，然后按1∶3-4的比例进行传代，换上新鲜的含有10％FBS的间充质干细胞完全培养基，于5％CO2培养箱37℃培养。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(7)为：每隔48h更换新鲜的含有10％FBS的间充质干细胞完全培养基，每周按1∶3-4传代2次，第3代后用于体内或体外实验。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述间充质干细胞完全培养基为含有8-12wt％胎牛血清的DMEM培养基。进一步优选的，所述间充质干细胞完全培养基为含有10wt％胎牛血清的DMEM培养基。本专利技术的有益效果是：本专利技术的培养方法是将骨髓里的杂细胞去除之后，将密质骨进行培养获得的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞在紧贴密质骨生长，长出的原代细胞都为骨髓间充质干细胞，细胞无需纯化，生长状态好，细胞生长整齐，无需进一步纯化，给后期间充质干细胞的应用带来了方便。附图说明图1为本专利技术实施例1的部分试验过程照片。图2为本专利技术实施例1的P0代的骨髓间充质干细胞的显微照片之一。图3为本专利技术实施例1的P0代的骨髓间充质干细胞的显微照片之二。图4为本专利技术实施例2的实验结果图。图5为本专利技术实施例3的实验结果图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。下述实施例中的间充质干细胞完全培养基为含有10wt％胎牛血清的DMEM培养基。实施例1(一)骨髓间充质干细胞培养(1)拉颈处死小鼠。70％酒精浸泡消毒。将小鼠至于灭菌的100-mm玻璃皿中，从腹股沟部位开始切开皮肤，剥离肌肉，在靠近躯干的地方断开下肢，分离出股骨。在腋窝处断开上肢，分理处肱骨(图1a)。拉下皮肤(图1b)。用眼科剪将肱骨、胫骨及股骨上面的肌肉、肌腱剥离干净(图1c)。将骨头置于灭菌纱布上(图1d)。仔细擦净骨头表面上覆盖的软组织(图1e)。然后将其放于5mL间充质干细胞完全培养基(0.1％双抗，2％FBS)。(2)为完全去除胫骨和股骨伤的造血干细胞，用眼科剪去除骨髓腔末端的骺(图1f)。毫升注射器吸取3mL间充质干细胞完全培养基，并插入骨髓腔内将骨髓冲出(图1g)。反复冲洗至少3次，直到骨头变白(图1h)(3)用镊子夹住肱骨、胫骨及股骨，用剪刀小心的将其剪成大约1-3mm3碎片(图1i)。用镊子将碎片转移至25-cm2塑料培养瓶中，用3mL间充质干细胞完全培养基(1mg/mL胶原酶II)悬浮。振荡(200r.p.m.)37℃消化0.5-2h。(4)当骨头碎片变得十分松散时停止消化。吸取弃掉消化所用的培养基及消化下来的细胞。用5mL间充质干细胞完全培养基冲洗3次后，将消化后的骨头转移至另一含6mL间充质干细胞完全培养基(10％FBS)的25-cm2塑料培养瓶中，置于5％CO2培养箱37℃培养3d。(5)在培养的第3d将培养基倒掉，以去除非粘附细胞及组织碎片，换上6mL间充质干细胞完全培养基(10％FBS)。培养结果如图2所示，P0代骨髓间充质干细胞，黑色的部分是密质骨，可见密质骨周边充满间充质干细胞，间充质干细胞呈梭形三角形，状态良好；如图3所示，P0代间充质干细胞，培养第10天，细胞纯度高，形状整齐。(6)培养5d后，传代。去除培养基。加入3mL0.25％胰酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)将实验哺乳动物处死并经乙醇水溶液浸泡消毒，将肌肉和肌腱剥离干净后分离出股骨、肱骨和胫骨，然后仔细擦净其上覆盖的软组织，接着置于含有0.08-0.12％双抗和1.8-2.2％FBS的间充质干细胞完全培养基中；/n(2)去除上述股骨、肱骨和胫骨的骨髓腔末端的骨骺，接着用间充质干细胞完全培养基将骨髓腔中的骨髓冲出并反复冲洗至股骨、肱骨和胫骨变白；/n(3)将变白的股骨、肱骨和胫骨剪成1-3mm

【技术特征摘要】
1.一种骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将实验哺乳动物处死并经乙醇水溶液浸泡消毒，将肌肉和肌腱剥离干净后分离出股骨、肱骨和胫骨，然后仔细擦净其上覆盖的软组织，接着置于含有0.08-0.12％双抗和1.8-2.2％FBS的间充质干细胞完全培养基中；
(2)去除上述股骨、肱骨和胫骨的骨髓腔末端的骨骺，接着用间充质干细胞完全培养基将骨髓腔中的骨髓冲出并反复冲洗至股骨、肱骨和胫骨变白；
(3)将变白的股骨、肱骨和胫骨剪成1-3mm3的碎片，用含有0.8-1.2mg/mL胶原酶II于36-38℃消化0.5-2h至碎片变得松散，弃掉消化液得消化碎片；
(4)将消化碎片用间充质干细胞完全培养基冲洗后，置于含有8-12％FBS的间充质干细胞完全培养基中，于4-6％CO2培养箱36-38℃培养3-7d；
(5)倒掉培养基，以去除非粘附细胞和组织碎片，换上新鲜的含有8-12％FBS的间充质干细胞完全培养基，于4-6％CO2培养箱36-38℃培养4.8-5.2d；
(6)倒掉培养基，加入含有0.015-0.024％EDTA的胰蛋白酶，室温下消化1-5min，然后按1：3-4的比例进行传代，换上新鲜的含有8-12％FBS的间充质干细胞完全培养基，于4-6％CO2培养箱36-38℃培养；
(7)每隔45-50h更换新鲜的含有8-12％FBS的间充质干细胞完全培养基，每周按1∶3-4传代1-2次，第3-8代用于体内或体外实验；
上述间充质干细胞完全培养基为含有2-15wt％胎牛血清的DMEM培养基。


2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将实验哺乳动物处死并经乙醇水溶液浸泡消毒，将肌肉和肌腱剥离干净后分离出股骨...

【专利技术属性】
技术研发人员：仝彩玲，
申请(专利权)人：生物角厦门科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35