一种制备修饰MSCs的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种制备修饰MSCs的方法及其应用，本发明专利技术通过研究发现了现有技术中MSCs不能于心理应激下有效实现MSCT疗效的原因，通过使用clathrin抑制剂、BECN1 siRNA、STAT3激活剂和let‑7k抑制剂中的其中一种对MSCs进行处理，制备得到修饰的MSCs，可重现实现MSCT的疗效；为制备治疗结肠炎，特别是心理缚应激结肠炎的药物提供了新的思路，具有重要的医学前景。

A method of preparing modified MSCs and its application

【技术实现步骤摘要】
一种制备修饰MSCs的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，涉及一种MSCs，具体涉及一种制备修饰MSCs的方法及其应用。
技术介绍
由于MSCs间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)来源广泛，易于获取，安全性好，具有显著的免疫抑制能力。间充质干细胞移植(MSCtransplantation，MSCT)已被应用于动物模型中治疗各种自身免疫病(系统性硬化症，系统性红斑狼疮，实验性自身免疫性脑脊髓炎和移植物抗宿主病等)、炎症性疾病(脓毒症和急性溃疡性肠炎等)以及过敏性疾病(哮喘和接触性皮炎等)等，并取得较好的疗效。然而MSCs的免疫调节功能显著受到宿主体内微环境影响。例如若宿主体内缺乏TNF-α和IFN-γ等炎症因子，MSCs的免疫调节功能将被显著抑制。心理应激普遍存在于炎症性疾病患者中，而心理应激显著改变机体微环境；在我们的研究中，我们发现MSCT可有效缓解结肠炎小鼠的症状，但无法治疗处于心理应激状态的结肠炎小鼠。因此，以往传统MSCT利用统一的MSCs治疗疾病没有考虑到宿主自身的体内微环境，可能导致一些患者治疗失败。因此，亟需要开发可用于治疗心理应激状态的结肠炎的药物。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种可可用于治疗心理应激状态的结肠炎的药物。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种制备修饰MSCs的方法，用clathrin抑制剂、BECN1siRNA、STAT3激活剂和let-7k抑制剂中的其中一种对MSCs进行预处理。其中，BECN1siRNA、STAT3激活剂和let-7k抑制剂均可调控MSCs的自噬水平，而自噬在调节MSC的免疫调节功能中发挥着重要作用。作为本专利技术的优选实施方式，所述clathrin抑制剂为Pitstop2；所述STAT3激活剂为colivelin。作为本专利技术的优选实施方式，使用所述clathrin抑制剂或所述STAT3激活剂制备修饰MSCs的方法为将clathrin抑制剂或STAT3激活剂直接加入MSCs培养基中；使用所述siRNA或所述let-7k抑制剂制备修饰MSCs的方法为利用LipofectamineRNAiMAX以及Opti-MEM将所述siRNA或所述let-7k抑制剂转染MSCs。本专利技术还要求保护根据所述方法制备得到的修饰MSCs。本专利技术还要求保护所述的修饰MSCs在制备治疗结肠炎的药物中的应用作为本专利技术的优选实施方式，所述结肠炎为处于心理应激的结肠炎。进一步地，本专利技术还提供了一种用于治疗结肠炎的组合物，所述组合物包括所述的修饰MSCs。作为本专利技术的优选实施方式，还包括药学上可接受的辅料。作为本专利技术的优选实施方式，所述组合物的剂型为注射剂。作为本专利技术的优选实施方式，所述结肠炎为处于心理应激的结肠炎。本专利技术通过研究发现了现有技术中MSCs不能有效实现MSCT的疗效的原因，通过使用clathrin抑制剂、BECN1siRNA、STAT3激活剂和let-7k抑制剂中的其中一种对MSCs进行预处理，制备得到修饰的MSCs，可重现实现MSCT的疗效，为制备治疗结肠炎，特别是心理缚应激结肠炎的药物提供了新的思路，具有重要的医学前景。附图说明图1为建立小鼠结肠炎模型及束缚应激模型的流程图。图2为Pitstop2处理实验中MSCs对血浆外泌体的摄取情况。图3为Pitstop2处理实验中各组小鼠的体重及DAI变化。图4为Pitstop2处理实验中各组小鼠结肠长度图片。图5为Pitstop2处理实验中各组小鼠结肠病理状况。图6为Pitstop2处理实验中各组小鼠脾脏流式细胞分析结果。图7为BECN1siRNA预处理前、后的MSCs自噬相关蛋白表达情况。图8为BECN1siRNA预处理后各组小鼠的体重及DAI变化。图9为BECN1siRNA预处理后各组小鼠结肠长度图片。图10为BECN1siRNA预处理后各组小鼠结肠病理状况。图11为BECN1siRNA预处理后各组小鼠脾脏流式细胞分析结果。图12为STAT3激活剂colivelin处理后的MSCs自噬相关蛋白表达情况。图13为STAT3激活剂colivelin处理后各组小鼠的体重及DAI变化。图14为STAT3激活剂colivelin处理后各组小鼠结肠长度图片。图15为STAT3激活剂colivelin处理后各组小鼠结肠病理状况。图16为STAT3激活剂colivelin处理后各组小鼠脾脏流式细胞分析结果。图17为let-7k抑制剂进行预处理后MSCs中let-7k的表达水平。图18为let-7k抑制剂进行预处理后MSCs中自噬相关蛋白表达水平。图19为let-7k抑制剂进行预处理后各组小鼠的体重及DAI变化。图20为let-7k抑制剂进行预处理后各组小鼠结肠长度图片。图21为let-7k抑制剂进行预处理后各组小鼠结肠病理状况。图22为let-7k抑制剂进行预处理后各组小鼠脾脏流式细胞分析结果。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1使用clathrin抑制剂制备修饰MSC的方法MSCs以3×105/mL密度接种于6孔板中，每孔1.5mL，培养24h后观察细胞贴壁，生长状态良好；细胞培养基中加入1.5μL的clathrin抑制剂(Pitstop2，200μM)，继续培养10分钟后收集细胞。实施例2使用STAT3激活剂制备修饰MSC的方法MSCs以3×105/mL密度接种于6孔板中，每孔1.5mL，培养24h后观察细胞贴壁，生长状态良好；细胞培养基中加入1.5μL的STAT3激活剂(colivelin，100μM，购于SantaCruzBiotechnology)，继续培养12小时后收集细胞。实施例3使用BECN1siRNA制备修饰MSC的方法MSCs以3×105/mL密度接种于6孔板中，每孔1.5mL，培养24h后观察细胞贴壁，生长状态良好；利用7μLLipofectamineRNAiMAX以及1mLOpti-MEM(LifeTechnologies)转染2.5μLBECN1siRNA(20μM，购于SantaCruzBiotechnology；c-29798)；48小时后收集细胞。所述siRNA的靶序列为CTCAGGAGAGGAGCCATTT。实施例4使用let-7k抑制剂制备修饰MSC的方法MSCs以3×105/mL密度接种于6孔板中，每孔1.5mL，培养24h后观察细胞贴壁，生长状态良好；利用7μLLipofectamineRNAiMAX以及1mLOpti-MEM(LifeTechnologies)转染5μLlet本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备修饰MSCs的方法，其特征在于，用clathrin抑制剂、BECN1 siRNA、STAT3激活剂和let-7k抑制剂中的其中一种对MSCs进行预处理。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备修饰MSCs的方法，其特征在于，用clathrin抑制剂、BECN1siRNA、STAT3激活剂和let-7k抑制剂中的其中一种对MSCs进行预处理。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述clathrin抑制剂为Pitstop2；所述STAT3激活剂为colivelin。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用所述clathrin抑制剂或所述STAT3激活剂制备修饰MSCs的方法为将clathrin抑制剂或STAT3激活剂直接加入MSCs培养基中；使用所述siRNA或所述let-7k抑制剂制备修饰MSCs的方法为利用LipofectamineRNAiMAX以及Opti-MEM将所述siRNA或所述let-...

【专利技术属性】
技术研发人员：田俊，韦曦，施松涛，
申请(专利权)人：中山大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：广东;44