一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用技术

一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用，所属间充质干细胞制备领域，本发明专利技术方法利用形成胚胎小体的分化方式来进行分化成干细胞，加入特定调控刚发育的干细胞因子STGF，包括bFGF、HGF、OSM来促使干细胞生长与分化，使相关干细胞基因的表现类似于发育的状态，成功打开干细胞激活人体机能的钥匙，能大规模激活干细胞。本发明专利技术方法培养法操作简便，经济成本低，所获得的细胞形态完整，纯度高，获得的脐带与胎盘间充质干细胞不表达造血干细胞等，能较好地保持细胞的活力。制备的间充质干细胞可应用于人体的皮肤疾病、血液系统疾病、神经系统疾病、实质器官损伤或病变、免疫系统疾病、心血管系统疾病、代谢性疾病、骨关节疾病、生殖系统疾病等。

Preparation and application of mesenchymal stem cells from umbilical cord and placenta

【技术实现步骤摘要】
一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用
本专利技术属于间充质干细胞培养领域，具体涉及一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
间充质干细胞(MSC，mesenchymalstemcells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简单，但骨髓提取手术较痛苦，且取材过程中和取材后会有很高感染性。胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，具有更大的应用潜能，能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。目前，现有的从胎盘和脐带中分离干细胞，从建立胎盘干细胞库的方法扔存在缺点，如纯度不足、数量不高，尚不能满足使用要求。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用，本专利技术方法利用形成胚胎小体的分化方式来进行分化成干细胞，加入特定调控刚发育的干细胞因子StemCellGrowthFactor(STGF)，包括bFGF、HGF、OSM来促使干细胞生长与分化，使相关干基因的表现类似于发育的状态，成功打开干细胞激活人体机能的钥匙，能大规模激活干细胞，提高纯度和数量。其具体技术方案如下：一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法，包含如下步骤：步骤1：在无菌条件下用DPBS洗净脐带血污，将人体脐带与胎盘组织剪成3～4cm小段，剔除3根血管及瘀血部分，然后将组织进一步分离，切割为2～3mm3大小的组织块；步骤2：向培养板中滴加少量间充质干细胞无血清培养基，使用吸管吸取组织块均匀散布在培养板中，使组织块间距为0.5～1cm，然后置于37℃，5％CO2培养箱孵育30～40min；步骤3：取出培养板，向培养板的每孔轻缓加入1～2ml含添加剂的间充质干细胞无血清培养基，再放回培养箱中培养；步骤4：第1天培养板每孔补加1ml完全培养基，第3天半量换液，第6天全量换液，此后每周换液2次，每天用倒置显微镜观察组织贴壁生长的细胞形态并记录，最早5天后在倒置相差显微镜下观察，发现有细小梭形的细胞从边缘爬出；步骤5：待细胞汇合生长80％以上后，吸弃培养板中的组织块及培养基，用DPBS溶液浸洗1次，然后加入重组胰酶1ml消化，轻敲培养板，使细胞彻底分离，加入5～6ml用DPBS溶液稀释的大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化，离心去掉上清液，用少量完全培养基重悬细胞，进行细胞计数；步骤6：调整细胞密度为5000个/cm2，接种于T25瓶中，在37℃，5％CO2培养箱培养；用倒置显微镜观察细胞生长情况并记录，培养细胞达80％融合时，进行传代培养；步骤7：离心收集细胞，将细胞悬浮于间充质干细胞冻存液中，调整细胞密度为(0.5～1)×106个/ml，然后装入冻存管，放入程序降温盒，-80℃冰箱放置24小时后，转入液氮中保存备用；所述步骤3中，添加剂为1～10ppmbFGF的B27无血清添加剂；所述步骤5中，重组胰酶为RecombinantTrypsinEDTASolution重组胰酶；所述步骤6中，传代培养为4～5天；所述步骤7中，冻存管规格为1ml/支；所述间充质干细胞无血清培养基为MSCXFBasalMedium间充质干细胞无血清培养基；所述培养板为6孔培养板；上述一种间充质干细胞的应用，包含对人体的皮肤疾病、血液系统疾病、神经系统疾病、实质器官损伤或病变、免疫系统疾病、心血管系统疾病、代谢性疾病、骨关节疾病、生殖系统疾病的应用。本专利技术的一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用，与现有技术相比，有益效果为：一、利用形成胚胎小体的分化方式来进行分化成干细胞，加入特定调控刚发育的干细胞因子StemCellGrowthFactor(STGF)，包括bFGF、HGF、OSM来促使干细胞生长与分化，使相关干基因的表现类似于发育的状态，成功打开干细胞激活人体机能的钥匙，能大规模激活干细胞，提高纯度和数量，满足使用要求。二、本专利技术方法细胞来源于脐带和胎盘组织，MSC间充质干细胞属于多功能干细胞，最终MSC会分化成脂肪、骨骼、软骨、肌肉、靭带甚至神经、血管、心脏、胰脏的β细胞以及肾脏等，帮忙恢复及修复受伤的组织。STGF干细胞因子主要包含bFGF碱性成纤维细胞因子，利用纳米泌体技术传递。STGF是万能因子，目的是激活MSC间充质干细胞。碱性纤维母细胞生长因子bFGF是人类胚胎干细胞和iPS细胞培养基的关键成份，ReproCell重组人类FGF-2(bFGF)的146个氨基酸，不管在喂养细胞有或无的培养情況下，皆能维持多能性干细胞的正常生长。STGF和MSC的协同作用，提高人体自身免疫力，修复人体8大系统，抗衰老。三、无血清培养体系较传统的含血清培养的区别是减少了培养基、胎牛血清以及双抗的使用，减低了培养成本，既能提升组织块贴壁率，增加细胞迁出率。缩短细胞从组织块迁出时间，又尽可能减少抗生素等对细胞生长的影响，并能消除有未确定的病原体引起的风险，并且保证细胞的纯度以及完整性。四、人脐带间充质干细胞(Humanumbilicalcordmesen-chymalstemcells，HUC-MSCs)是一类来源于新生儿脐带组织的具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，具有向神经、血管、肌肉、骨、软骨、脂肪等多种功能细胞分化的潜能。本专利技术方法制备的间充质干细胞，纯度高，修复性强，可大幅提高身体免疫力和人体系统抗衰修复，减缓自身衰老细胞老化，改善受伤内脏组织和免疫系统。五、本专利技术方法培养法操作简便，经济成本低，所获得的细胞形态完整，纯度高，获得的脐带间充质干细胞不表达造血干细胞等，能较好地保持细胞的活力，具有良好的工业实现性。附图说明图1为HUC-MSCs原代细胞密度：其中，左图为培养5天(10×4)细胞刚从组织块爬出的电镜图，右图为培养10天(10×10)细胞分散好的电镜图；图2为HUC-MSC第一代细胞密度：其中，左图为培养24h(10×4)电镜图，右图为培养24h(10×10)电镜图；图3为HUC-MSC第一代细胞密度：其中，左图为培养72h(10×4)电镜图，右图为培养72h(10×10)电镜图；图4为HUC-MSC第一代细胞密度：其中，左图为培养96h(10×4)电镜图，右图为培养96h(10×10)电镜图；图5为长扁平的梭形、涡旋状成纤维细胞电镜图；...

【技术保护点】
1.一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：/n步骤1：/n在无菌条件下用DPBS洗净脐带血污，将人体脐带与胎盘组织剪成3～4cm小段，剔除3根血管及瘀血部分，然后将组织进一步分离，切割为2～3mm

【技术特征摘要】
1.一种脐带与胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤1：
在无菌条件下用DPBS洗净脐带血污，将人体脐带与胎盘组织剪成3～4cm小段，剔除3根血管及瘀血部分，然后将组织进一步分离，切割为2～3mm3大小的组织块；
步骤2：
向培养板中滴加少量间充质干细胞无血清培养基，使用吸管吸取组织块均匀散布在培养板中，使组织块间距为0.5～1cm，然后置于37℃，5％CO2培养箱孵育30～40min；
步骤3：
取出培养板，向培养板的每孔轻缓加入1～2ml含添加剂的间充质干细胞无血清培养基，再放回培养箱中培养；
步骤4：
第1天培养板每孔补加1ml完全培养基，第3天半量换液，第6天全量换液，此后每周换液2次，每天用倒置显微镜观察组织贴壁生长的细胞形态并记录，最早5天后在倒置相差显微镜下观察，发现有细小梭形的细胞从边缘爬出；
步骤5：
待细胞汇合生长80％以上后，吸弃培养板中的组织块及培养基，用DPBS溶液浸洗1次，然后加入重组胰酶1ml消化，轻敲培养板，使细胞彻底分离，加入5～6ml用DPBS溶液稀释的大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化，离心去掉上清液，用少量完全培养基重悬细胞，进行细胞计数；
步骤6：
调整细胞密度为5000个/cm2，接种于T25瓶中，在37℃，5％CO2培养箱培养；用倒置显微镜观察细胞生长情况并记录，培养细胞达80％融合时，进行传代培养；
步骤7：
离心收集细胞，将细胞悬浮于间充质干...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏木，陈靖明，伯特兰卡纳维，特里斯坦罗贵尔，
申请(专利权)人：福州艾非儿大健康管理有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35