一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术以N和C端(GPP)

Preparation of a type I collagen fiber

【技术实现步骤摘要】
一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法
本专利技术涉及一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法，属于基因工程

技术介绍
胶原蛋白是一种生物性的高分子，是由三条链相互缠绕形成的三股螺旋结构。胶原蛋白根据其基因序列和功能作用可分为28种类型，其中最为主要是的I型胶原蛋白。在高等生物细胞中，I型胶原的原蛋白经过翻译后修饰、折叠、切割等一系列成熟化过程后，多个胶原蛋白三股螺旋(简称胶原蛋白)交错排列，形成间距均匀的明暗条纹状的胶原蛋白纤维(图1),其形貌对于细胞的粘附与生长有关键性的作用[1]，也是促进人体组织和器官的修复和再生的生物材料。I型胶原蛋白主要用于治疗皮肤烧伤的创面敷贴、外科和牙科手术的止血海绵、骨缺损填充物等生物医用材料中，也广泛应用于化妆品与食品工业中，市场需求量庞大。目前市场上的I型胶原蛋白产品主要是来源于动物皮肤与跟腱等结缔组织，其主要优点是生物兼容性高、易被人体吸收，但是易被动物源带有的疾病如朊蛋白等污染。为了提高胶原材料的生物安全性，如何制备清洁来源的I型胶原蛋白是生物医学材料领域中备受关注的问题。目前主要有以下三种制备方法：(1)化学合成胶原样多肽，(2)原核与真核微生物宿主异源表达重组胶原蛋白，(3)高等生物宿主异源表达，如转基因植物培育、动物细胞培养。化学合成的胶原样多肽虽然具有纯度高、易于修饰功能基团等优点，但是制备成本过高，不利于大规模生产。转基因植物和哺乳动物细胞表达体系的普遍问题是培养条件严苛、表达量低、生产周期长。微生物表达体系具有成本低和表达量高等明显优势。目前研究表明，越来越多的哺乳动物和细菌胶原被证实能够在细菌和酵母等宿主中高效的异源表达，并且正确折叠成胶原蛋白三股螺旋。重组胶原在生物材料生产中具有潜在的应用，但是缺乏形成高级结构的自组装驱动力，不能形成胶原蛋白纤维，限制了其在生物材料和组织工程方面的应用。BarbaraBrodsky等人通过表达全长和两倍长度的酿脓链球菌胶原蛋白Scl2，切除球状引导折叠域后的胶原区域能够自组装形成纤维，通过加长序列长度能够促进自组装的能力，但是这些重组胶原序列无法形成与天然胶原类似的、具有规整明暗条带的纳米纤维形貌[2]。参考文献：1.Friedrichs,J.,A.Taubenberger,C.M.Franz,andD.J.Muller,CellularRemodellingofIndividualCollagenFibrilsVisualizedbyTime-lapseAFM.JournalofMolecularBiology,2007.372(3):p.594-607.2.Nelson,D.L.,A.L.Lehninger,andM.M.Cox,Lehningerprinciplesofbiochemistry.2008:Macmillan.
技术实现思路
本申请通过在不同来源的胶原蛋白的N端和C端融合表达(GPP)10，促进胶原蛋白的高聚自组装，形成胶原蛋白纤维。本专利技术的第一个目的是提供一种类I型胶原蛋白，由三条蛋白单链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成三螺旋结构；所述蛋白单链的氨基酸排布方式为：其中，(GPP)n的n满足5＜n≤30，CL-domain的氨基酸序列如SEQIDNO.2～6任一序列所示。本专利技术的第二个目的是提供一种用于表达类I型胶原蛋白的蛋白单链，其氨基酸序列如所示；其中，V-domain的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；(GPP)n中的n≥5；CL-domain的氨基酸序列如SEQIDNO.2～6任一序列所示。在一种实施方式中，所述V-domain和(GPP)n之间通过LVPRGSP连接。在一种实施方式中，(GPP)n中的n满足5＜n≤30。在一种实施方式中，所述V-domain前端还融合6×His标签。本专利技术的第三个目的是提供编码所述蛋白单链的基因。在一种实施方式中，所述基因含有SEQIDNO.13～18任一所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的质粒或细胞。在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于：pColdIII系列和pET系列质粒。在一种实施方式中，所述质粒为pColdIII。在一种实施方式中，所述细胞为大肠杆菌细胞，包括但不限于E.coliBL21、E.coliBL21(DE3)、E.coliJM109、E.coliDH5α或E.coliTOP10。本专利技术的第五个目的是保护含有所述类I型胶原蛋白的胶原蛋白纤维；所述胶原蛋白纤维具有明暗相间的条纹形态。在一种实施方式中，所述胶原蛋白纤维是由所述胶原蛋白高聚自组装形成。本专利技术的第六个目的是提供一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)合成编码类I型胶原蛋白单链的基因；(2)将步骤(1)合成的基因与载体连接，转化至目的细胞中表达并纯化；(3)向步骤(2)的纯化产物中加入胰蛋白酶，25℃温度下反应至少6h；(4)将步骤(3)获得的胶原蛋白配制成浓度为0.1～1mmol/L的溶液，于2℃～37℃静置。在一种实施方式中，所述静置时间不少于24h。在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13～18所示。在一种实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：(1)胶原蛋白重组质粒的构建：合成分别如SEQIDNO.13～18所示的编码胶原蛋白的基因v-P10AP10,v-P10BP10,v-P10CP10,v-P10B2P10,vP10ABCP10和v-P10HP10，并分别构建到质粒pColdIII-Tu上；所述pColdIII-Tu是以pCOLD-TU(NcoI)-S:CTCGAGGGATCCGAATTCA(SEQIDNO.23所示),pCOLD-TU(NcoI)-A:GAGCTCCATGGGCACTTTG(SEQIDNO.24所示)为引物，对pColdIII质粒进行突变，以引入NcoI位点；(2)转化：将重组质粒分别转化到E.coliBL21(DE3)中。(3)诱导表达：接单菌落于LB液体培养基过夜培养，然后按1％的接种量转接TB液体培养基，37℃培养24h，加入IPTG，25℃诱导10h，转15℃诱导14h。(4)纯化：收集发酵菌体。用磷酸盐缓冲液重悬菌体，在冰浴条件下，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，然后在4℃下，10000rpm离心20min去除细胞碎片，再将上清用微孔滤膜过滤去除杂质；将样品注入安装于蛋白纯化仪的His-traphp亲和层析柱(5mL)中，然后用洗涤液冲洗8个柱体积，洗脱缓冲液中咪唑的含量呈阶梯状(140mM,400mM)增加，用来洗脱蛋白质，收集出峰蛋白，经胰蛋白酶酶切后透析后，冻干。(5)将步骤(4)冻干后的胶原蛋白配制成浓度为0.5mmol/L的溶液，于4℃～37℃静置至少2天。本专利技术还要求保护所述胶原蛋白、基因、质粒、细胞或制备方法在生物、化工、食品、医药、生物材料、组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于表达类I型胶原蛋白的蛋白单链，其特征在于，氨基酸序列如

【技术特征摘要】
1.一种用于表达类I型胶原蛋白的蛋白单链，其特征在于，氨基酸序列如所示；其中，V-domain的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；(GPP)n中的n≥5；CL-domain的氨基酸序列如SEQIDNO.2～6任一序列所示。


2.根据权利要求1所述的蛋白单链，其特征在于，所述V-domain和(GPP)n之间通过LVPRGSP连接；
可选地，所述V-domain前端具有6×His标签。


3.编码权利要求1或2所述类I型胶原蛋白的基因。


4.携带权利要求3所述基因的质粒或细胞。


5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，包括但不限于：pColdIII系列或pET系列的质粒。


6.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，为大肠杆菌细胞，包括E.coliBL21、E.coliBL21(DE3)、E.coliJM109、E.coliDH5α或E.coliTOP10。


7.类I型胶原蛋白，其特征在于，由三条如(a)或(b)所示的蛋白单链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成三螺旋结构：
(a)其中，V-domain的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：许菲，胡金远，维卡斯·南达，戴维·史瑞伯，张萌，锁娜儿·格拉瓦特，
申请(专利权)人：江南大学，罗格斯大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32