本发明专利技术提供了一种基于SNAP‑tag技术的细胞膜荧光探针及其制备和应用，该荧光探针基于罗丹明6G小分子荧光染料、连接SNAP蛋白标签BG基团，其结构式如(1)所示。本发明专利技术涉及的荧光探针具有小分子荧光染料优异的光稳定性、荧光亮度的优势，同时与现有的利用小分子染料双亲性(亲水亲油性)识别细胞膜不同，该探针可以专一的共价键结合细胞膜SNAP蛋白，结合更为稳固，可长时间成像观测；且其合成步骤简单、原料廉价易得，在细胞膜成像领域中有着巨大的应用前景。
A cell membrane fluorescent probe based on snap tag technology and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针及其制备和应用
本专利技术属荧光成像领域，具体涉及一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针及其制备和应用。
技术介绍
基于有机小分子荧光染料的SNAP-tag蛋白标签技术，具有独特的优点：蛋白标签与底物的反应速度快且特异性高；通过共价键的结合蛋白标记的稳定性好，即使在体外分析SDS-PAGE的变性条件下仍可稳定标记；通过模块化的设计将标签特异性底物BG基团与功能染料结合,灵活性高；便于衍生多样化的荧光染料，通用性强，可满足各种荧光成像研究的需求。目前，SNAP-tag在细胞内蛋白质标记、体外分析及靶向荧光的检测的研究中获得了非常广泛的应用。尽管如此，这种方法也存在些许不足：为了达到更高的信号强度、提高信噪比，需要充分的洗涤去除非特异性染色，这也限制了其在活细胞实时成像中的应用。细胞膜又称质膜，其主要是由磷脂构成的富有弹性的半透性膜，在生命活动过程中占据着十分重要的位置，如选择性地交换物质，吸收营养物质，排出代谢废物，分泌与运输蛋白质。但是目前关于细胞膜成像的荧光探针主要以分子双亲性(亲水亲油性)插入到细胞膜上，无法人为控制其细胞膜的渗透性，进行长时间的成像观察。小分子荧光染料的SNAP-tag蛋白标签技术则可以完美的解决了这一缺陷，有望实现对细胞复杂的生命过程中细胞膜变化的实时追踪。因此，开发设计出基于有机小分子荧光染料的SNAP-tag蛋白标签技术的细胞膜荧光探针显得十分迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针及其制备和应用，该细胞膜荧光探针光稳定性高、亮度高，以及较高的细胞非渗透性，可以长时间进行细胞膜的成像研究。本专利技术一种基于SANP-tag技术的细胞膜荧光探针，其以罗丹明6G为荧光母体，对氨基鸟嘌呤为识别基团，具体的化学结构如下：其中:n＝0,1,2,3或4。本专利技术的荧光探针由于其较高的非渗透性，较难以进入细胞中，同时其能够特异性的与细胞膜表面转染的SNAP蛋白相结合，从而在细胞膜上聚集，实现快速、清晰的细胞膜蛋白成像的目的。一种基于SANP-tag技术的细胞膜荧光探针的制备方法，其合成路线如下：具体合成步骤如下：(1)中间体罗丹明6G-羧酸的合成罗丹明6G溶于乙醇中，加入强碱试剂的水溶液，回流反应5-10h后，减压除去有机溶剂，硅胶柱分离,洗脱剂为体积比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得中间体。(2)中间体罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯的合成将罗丹明6G-羧酸，N-羟基琥珀酰亚胺，缩合试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐依次加入到二氯甲烷中，室温搅拌10-16h，减压除去溶剂得粗产品。(3)中间体罗丹明6G-甲胺烷基酸得合成将罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯粗产品、甲胺丁酸盐酸盐、碳酸钾依次加入到乙腈中，室温搅拌过夜；减压除去溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比50-10:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得紫色固体。(4)探针的合成将罗丹明6G-甲胺烷基酸、氨基鸟嘌呤、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、碳酸钾依次加入到N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌两天；减压除去溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比40-3:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得紫色固体。步骤(1)中：罗丹明6G与强碱的质量比为1:0.2-0.4，水与乙醇的体积比为1:5-8，罗丹明6G与乙醇的质量与体积比为1:20-40g/mL。步骤(2)中：罗丹明6G-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:0.2-0.4:0.6-0.8，罗丹明6G-羧酸与二氯甲烷的质量与体积比为1:40-60g/mL。步骤(3)中：罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯与甲胺烷基酸盐酸盐、碳酸钾的质量比为1:0.3-0.6:0.2-0.4，罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯与乙腈的质量与体积比为10-25:1mg/mL。步骤(4)中：罗丹明6G-甲胺丁酸、氨基鸟嘌呤、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、碳酸钾的质量比为1:0.4-1:0.4-0.6:0.3-0.5:1-2，罗丹明6G-甲胺丁酸与N,N-二甲基甲酰胺的质量与体积比为5-10:1mg/mL。步骤(1)中：强碱试剂为KOH、NaOH、LiOH，反应时间以点板检测为基准，直到原料基本反应完全就停止反应。步骤(2)中：缩合试剂为DCC,EDC,HOBt中的一种或多种。本专利技术提供了一种基于SANP-tag技术的细胞膜荧光探针，该荧光探针具有光稳定性高、荧光亮度高、非渗透性高等特点，可以进行快速、免洗的细胞膜成像。本专利技术一种基于SANP-tag技术的小分子细胞膜荧光探针的制备方法，该方法具有原料低廉、操作简便等特点。本专利技术涉及的荧光探针具有小分子荧光染料优异的光稳定性、荧光亮度的优势，同时与现有的利用小分子染料双亲性(亲水亲油性)识别细胞膜不同，该探针可以专一的共价键结合细胞膜SNAP蛋白，结合更为稳固，可长时间成像观测；且其合成步骤简单、原料廉价易得，在细胞膜成像领域中有着巨大的应用前景。附图说明图1实施例得到的探针Rho6G-SNAP高分辨质谱；图2实施例得到的探针Rho6G-SNAP在DMSO中的紫外吸收图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；图3实施例得到的探针Rho6G-SNAP在DMSO中的荧光发射图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；图4实施例得到的探针Rho6G-SNAP在转染SNAP蛋白的细胞膜成像图，成像浓度为0.5μM。具体实施方法实施例1用于细胞膜成像的小分子荧光探针Rho6G-SNAP的合成方法。中间体罗丹明6G-羧酸的合成：将1g的罗丹明6G溶于30mL乙醇中，300mg的氢氧化钠溶于5mL水中后缓慢加入到反应混合物中，加热搅拌回流。6h后，点板监测，待反应原料反应完全，停止反应。旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离，用二氯甲烷:甲醇＝5:1(体积比)作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫色固体700mg，产率80％。其核磁谱图氢谱数据如下：1HNMR(400MHz,CD3OD),δ8.22(d,J＝6.4Hz,1H),7.80(m,2H),7.36(d,J＝6.8Hz,1H),6.89(d,J＝10.4Hz,4H),3.50(q,J＝7.2Hz,4H),2.15(s,6H),1.35(t,J＝6.8Hz,6H).中间体罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯的合成：称取500mg的罗丹明6G-羧酸和345mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐于25mL的二氯甲烷中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺125mg，在室温下搅拌12h。停止反应，旋本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针，其特征在于该荧光探针以罗丹明6G为荧光母体，对氨基鸟嘌呤为识别基团，其结构如下所示：/n
【技术特征摘要】
1.一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针，其特征在于该荧光探针以罗丹明6G为荧光母体，对氨基鸟嘌呤为识别基团，其结构如下所示：
其中:n＝0,1,2,3,4。
2.根据权利要求1所述一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)中间体罗丹明6G-羧酸的合成
罗丹明6G溶于乙醇中，加入强碱试剂的水溶液，回流反应5-10h后，减压除去有机溶剂，硅胶柱分离,洗脱剂为体积比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得中间体；
(2)中间体罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯的合成
将罗丹明6G-羧酸，N-羟基琥珀酰亚胺，缩合试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐依次加入到二氯甲烷中，室温搅拌10-16h，减压除去溶剂得粗产品；
(3)中间体罗丹明6G-甲胺烷基酸得合成
将罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯粗产品、甲胺丁酸盐酸盐、碳酸钾依次加入到乙腈中，室温搅拌过夜；减压除去溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比50-10:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得紫色固体；
(4)探针的合成
将罗丹明6G-甲胺烷基酸、氨基鸟嘌呤、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、碳酸钾依次加入到N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌两天；减压除去溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比40-3:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得紫色固体。
3.根据权利要求2所述一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中：罗丹明6G与强碱的质量比为1:0.2-0.4，
水与乙醇的体积比为1:5-8，
罗丹明6G与乙醇的质量与体积比为1:20-40g/mL。
4.根据权利要求2所述一种基于SNAP-tag技术的细...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，周伟，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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