生物碱cyanogramide的生物合成基因簇及其应用制造技术

本发明专利技术公开了生物碱cyanogramide的生物合成基因簇及其应用。本发明专利技术的来源于放线菌A.cyanogriseus WH1‑2216‑6(保藏编号为：CCTCC NO:M 2009277)的cyanogramide生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第393～13440位的碱基序列所示，包含10个基因；其中的P450氧化酶基因cyaH，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第10626～11843位的碱基序列的反向互补序列，编码P450氧化酶CyaH，其能以Fdx、Fdr和NADPH为辅因子催化cyanogramide D通过骨架重排生成cyanogramide。本发明专利技术所提供的包含cyanogramide生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解cyanogramide家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明专利技术所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Biosynthetic gene cluster of alkaloid cyanogradie and its application

【技术实现步骤摘要】
生物碱cyanogramide的生物合成基因簇及其应用
：本专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及一种氧化吲哚螺环生物碱类化合物cyanogramide的生物合成基因簇及其应用。
技术介绍
：Cyanogramide(图1中的1)是从一株浅蓝异壁放线菌ActinoalloteichuscyanogriseusWH1-2216-6的培养物中分离得到，属于生物碱类化合物，具有独特的氧化吲哚螺环结构。Cyanogramide(1)具有逆转肿瘤细胞抗性的活性，相应的机理正在深入研究中。近十多年来发展起来的组合生物合成技术为改造复杂天然产物提供了新的思路和方法。在阐明了自然界的生物合成途径、克隆和鉴定微生物天然产物生物合成基因簇的基础上，采用组合生物合成技术对发现的生物合成基因进行缺失、重组和异源表达，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。迄今为止，关于cyanogramide(1)生物合成基因簇克隆鉴定，构建重组菌株产生cyanogramide(1)及同系物，以及cyanogramide(1)结构中螺环的形成机制等国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种生物碱类化合物cyanogramide(1)的生物合成基因簇，其来源于浅蓝异壁放线菌A.cyanogriseusWH1-2216-6。本专利技术的cyanogramide(1)的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第393～13440位的碱基序列所示，包含10个基因，具体为：(1)负责β-咔啉碱骨架合成的基因，即cyaA、cyaB和cyaC共3个基因：cyaA位于基因簇核苷酸序列第393-1946个碱基处，长度为1554个碱基对，编码脂肪酸CoA连接酶，517个氨基酸；cyaB位于基因簇核苷酸序列第3455-4399个碱基处，长度为945个碱基对，编码Pictet–Spengler环化酶，314个氨基酸；cyaC位于基因簇核苷酸序列第4420-6111个碱基处，长度为1692个碱基对，编码脱羧酶，563个氨基酸；(2)负责甲基化基因，即cyaD、cyaE和cyaF共3个基因：cyaD位于基因簇核苷酸序列第6159-7190个碱基处，长度为1032个碱基对，编码甲基转移酶，343个氨基酸；cyaE位于基因簇核苷酸序列第7226-8008个碱基处，长度为783个碱基对，编码甲基转移酶，260个氨基酸；cyaF位于基因簇核苷酸序列第8583-9311个碱基处，长度为729个碱基对，编码甲基转移酶，242个氨基酸；(3)负责氧化的基因，即cyaG、cyaH和cyaI共3个基因：cyaG位于基因簇核苷酸序列第9326-10579个碱基处，长度为1254个碱基对，编码细胞色素p450氧化酶，417个氨基酸；cyaH位于基因簇核苷酸序列第10626-11843个碱基处，长度为1218个碱基对，编码细胞色素p450氧化酶，405个氨基酸；cyaI位于基因簇核苷酸序列第12226-13440个碱基处，长度为1215个碱基对，编码细胞色素p450氧化酶，404个氨基酸；(4)其它基因orf1位于基因簇核苷酸序列第2019-3218个碱基处，长度为1200个碱基对，编码细胞色素p450氧化酶，399个氨基酸；SEQIDNO.1的第1位到15458位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。SEQIDNO.1的第1位到15458位的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。本专利技术提供了得到至少包含部分SEQIDNO.1的第1位到15458位中DNA序列的重组DNA载体的途径。本专利技术提供了创制cyanogramide(1)生物合成基因异源表达等其他基因改造的途径，至少其中之一的基因包含SEQIDNO.1所示序列的第393-13440位中DNA片段。本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可使用PCR探针法或Southern杂交等技术，从其他生物体重筛选获得cyanogramide(1)生物合成基因簇同源基因。包含本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段，可以被体内外突变等修饰，包括插入、置换、缺失、易错聚合酶链式反应、位点特异性突变、不同序列重组、定向进化等。包含本专利技术所提供核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过DNA重组技术构建重组载体，以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活，进而获得其他基于生物合成途径的新结构化合物。本专利技术提供了AcyanogriseusWH1-2216-6中cyanogramide(1)生物合成基因簇在制备cyanogramide(1)及其类似物中的应用。本专利技术提供了基因cyaA、cyaB、cyaC、cyaD、cyaE、cyaF、cyaG、cyaH和cyaI联合在制备cyanogramide(1)及其类似物中的应用。一种基因工程菌，其特征在于，含有基因cyaA、cyaB、cyaC、cyaD、cyaE、cyaF、cyaG、cyaH和cyaI。所述的cyanogramide的类似物为cyanogramideB(2)、cyanogramideC(3)、cyanogramideD(4)和mrinacarbolinesE(5)和mrinacarbolinesF(6)：本专利技术提供了一种P450氧化酶基因cyaH，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1第10626-11843位碱基所示。上述P450氧化酶酶基因cyaH编码的P450氧化酶CyaH，以及在CyaH在制备cyanogramide(1)中的应用。本专利技术还提供了P450氧化酶在催化底物cyanogramideD转变为产物cyanogramide中的应用；总之本专利技术所提供的包括cyanogramide(1)生物合成相关的所有基因和蛋白信息，帮助人们理解生物碱类天然产物氧化重排生成螺环的关键机制，为进一步遗传改造提供材料和理论基础。本专利技术中的cyanogramide(1)生产菌株放线菌A.cyanogriseusWH1-2216-6，该菌于2009年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO:M2009277，该菌公开于专利申请号201710181976.7，专利技术名称为5,5,6-多环含特特拉姆酸大环内酰胺类化合物及其制备方法和用途的专利申请中。该放线菌菌株WH1-2216-6的详细信息已报道于(FuPeng,WangShuxia,HongKui,LiXia,LiuPeipei,WangYi,Z本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.cyanogramide的生物合成基因簇，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第393～13440位的碱基序列所示。/n

【技术特征摘要】
1.cyanogramide的生物合成基因簇，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1的第393～13440位的碱基序列所示。


2.权利要求1所述的cyanogramide的生物合成基因簇在制备化合物cyanogramide及其类似物中的应用。


3.基因cyaA、cyaB、cyaC、cyaD、cyaE、cyaF、cyaG、cyaH和cyaI联合在制备cyanogramide及其类似物中的应用；
cyaA如SEQIDNO.1的第393-1946个碱基所示；
cyaB如SEQIDNO.1的第3455-4399个碱基所示；
cyaC如SEQIDNO.1的第4420-6111个碱基所示；
cyaD如SEQIDNO.1的第6159-7190个碱基所示；
cyaE如SEQIDNO.1的第7226-8008个碱基所示；
cyaF如SEQIDNO.1的第8583-9311个碱基所示；
cyaG如SEQIDNO.1的第9326-10579个碱基所示
cyaH如SEQIDNO.1的第10626-11843个碱基所示；
cya...

【专利技术属性】
技术研发人员：张长生，朱义广，张庆波，方春艳，张丽萍，马亮，彭璟，朱伟明，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44